黄伟鹏+黄燕芬+陈建真+金波+谭佳宁+丁志山

[摘要] 查尔酮类化合物是一种广泛存在于多种药用植物中的黄酮类化合物，具有抑制细胞成脂分化的作用。为研究山核桃叶中提取分离得到的球松素查尔酮对小鼠胚胎间充质干细胞（C3H10T1/2）成脂分化的影响，该实验利用MTS[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）- 2H-tetrazolium，内盐]法检测细胞增殖情况；油红O染色和异丙醇萃取法检测细胞成脂分化情况；GAP-PAP酶法检测细胞中甘油三酯含量；分别采用荧光RT-PCR和Western blot检测成脂分化关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ），CCAAT增强子结合蛋白α （C/EBPα）和分化标志物脂肪型脂肪酸结合蛋白（FABP4） mRNA和蛋白表达。结果显示当球松素查尔酮浓度小于等于50 μmol·L^-1，对C3H10T1/2细胞的增殖活性无影响；油红O染色和异丙醇萃取法及GAP-PAP酶法检测结果表明球松素查尔酮能明显减少C3H10T1/2细胞成脂分化和甘油三酯含量；荧光RT-PCR和Western blot检测表明球松素查尔酮能下调FABP4，PPARγ和C/EBPα mRNA和蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）。结果提示，球松素查尔酮能够明显抑制C3H10T1/2细胞成脂分化。

[关键词] 球松素查尔酮； 成脂分化

[Abstract] Chalcones is a flavonoid wildly presented in many herbs. It has the effect to inhibit cells adipogenic differentiation. In order to study the effect of pinostrobin chalcone extracted and isolated from leaves of hickoryes on the adipogenic differentiation of murine embryonic mesenchymal stem cell （C3H10T1/2）， MTS [3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）- 2H-tetrazolium] method was used to detect the cell proliferation； adipogenic differentiation was characterized by oil red O staining and isopropanol extraction； the triglyceride content was detected by GAP-PAP enzyme method； and the C3H10T1/2 cell differentiation into adipocytes was also examined by the mRNA and protein expression of PPARγ， C/EBPα and FABP4 by RT-PCR and Western blot respectively. Results indicated that pinostrobin chalcone almost had no effect on cell proliferation activity when the concentration was less than or equal to 50 μmol·L^-1； the oil red O staining， isopropanol extraction and GAP-PAP enzyme method showed that pinostrobin chalcone significantly decreased the C3H10T1/2 adipogenic differentiation and triglyceride content in the cytoplasm of adipocytes； the RT-PCR and Western blot analysis showed that pinostrobin chalcone can down-regulate the mRNA and protein levels of FABP4， PPARγ and C/EBPα in C3H10T1/2 cells（P<0.05 or P<0.01）. The experiment results suggest that pinostrobin chalcone can inhibit C3H10T1/2 adipogenic differentiation.

[Key words] pinostrobin chalcone； adipogenic differentiation

随着生活水平提高，肥胖已经成为影响人类健康的重要因素。肥胖症是由于脂肪细胞过度分化和脂肪颗粒在脂肪细胞中过度沉积而引起的慢性炎症性疾病[1]。肥胖被視为心脑血管疾病、2型糖尿病、消化系统疾病等的危险因素[2]。间充质干细胞是一类可进行自我复制并能向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等多方向分化的成体干细胞[3]。间充质干细胞受PPARγ和CCAAT调节/增强子结合蛋白（C/EBP）等转录因子的影响，导致脂结合蛋白4、脂联素等成脂分化标志基因表达增加，进而使胞内甘油三酯逐步累积，形成脂肪细胞[4]。

球松素查尔酮是本实验室从山核桃叶总黄酮中分离[5]，同时还公开了山核桃叶提取物制备用于预防或治疗雌激素分泌不足相关疾病药物的新用途的一项发明专利[6]。据文献报导，查尔酮类化物具有抑制细胞成脂分化的作用[7]。提示山核桃叶总黄酮中的球松素查尔酮可能具有减肥的功效。本实验旨在研究球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响，为黄酮类化合物治疗肥胖相关疾病提供理论基础和药物来源。

1 材料

1.1 细胞株 C3H10T1/2细胞株，购于中国科学院上海生命科学院生物化學与细胞生物学研究所。

1.2 药物与试剂 球松素查尔酮为本实验室提取[8]（浙江中医药大学分子遗传研究所制备，纯度达99.4%）；DMEM高糖培养液（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；无支原体胎牛血清、牛胰岛素、地塞米松、罗格列酮、油红O（美国Sigma公司）；MTS（美国Promega公司）；甘油三酯试剂盒（南京建成科技有限公司）；TRizol（美国Invitrogen公司）；cDNA第1链合成试剂盒（日本Takara公司）；PCR上下游引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成，见表1。

1.3 仪器 AR1140电子天平（美国奥豪斯公司）；SW-CJ-1F超净工作台（苏净集团安泰公司）；ECLIPSE Ti-DH荧光倒置显微镜（日本尼康公司）；MQX 200酶标仪（美国BioTeK公司）；StepOne Plus Real-Time PCR System（美国Applied Biosystems公司）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 C3H10T1/2细胞培养 使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37 ℃，5%CO₂的培养箱中培养。当细胞融合至80%左右时，按1∶3传代。

2.2 MTS检测球松素查尔酮对细胞增殖抑制的影响 取对数生长期C3H10T1/2细胞密度稀释至1×104个/mL细胞悬液，按100 μL/孔接种于96孔板，在5%CO₂，37 ℃培养箱中，待细胞融合度达80%左右，继续培养于含有不同浓度的球松素查尔酮（20，40，60，80，100 μmol·L^-1）培养基中培养48 h。每孔加入20 μL MTS孵育2 h，在490 nm波长处用酶标仪测量吸光度。

2.3 C3H10T1/2细胞成脂分化诱导实验 取对数生长期C3H10T1/2细胞密度稀释至1×104个/孔的细胞悬液接种到24孔板中，于37 ℃，5%CO₂饱和湿度培养箱内培养2～3 d，待细胞融合达到接触抑制后，加入含球松素查尔酮的分化诱导剂A（1.0 μmol·L^-1地塞米松，10 mg·L^-1胰岛素，1.0 μmol·L^-1罗格列酮[9]），3 d后更换含球松素查尔酮的成脂诱导液B（10 mg·L^-1胰岛素，1.0 μmol·L^-1罗格列酮）进行维持，之后每隔24 h换1次含药诱导液B，诱导10 d后检测。

2.4 油红O染色检测及半定量分析 油红O用无水异丙醇配制成0.5%（W/V）储存液，使用时与双蒸水按3∶2配制成工作液。用预冷的PBS清洗细胞2次，福尔马林固定液在室温下固定30 min。弃去固定液，用PBS清洗2次，加入油红O染色液于室温下染色30 min，PBS清洗非特异性结合染料，于倒置显微镜下拍照；吸出孔中液体并在每孔加入200 μL（24孔板）无水异丙醇，使脂滴结合的油红O全部被溶解，于500 nm处测吸光度。

2.5 甘油三酯含量 取对数生长期C3H10T1/2细胞，按5×104个/孔的密度接种到6孔板中，成脂诱导第10天用胰酶将细胞消化下来，12 000 r·min^-1离心5 min，弃上清，加入100 μL细胞裂解液，于冰上裂解30 min，测定蛋白浓度，按试剂盒说明书测定甘油三酯含量。

2.6 荧光定量PCR检测 C3H10T1/2细胞成脂分化诱导10 d后（同2.5项），Trizol法抽提细胞总RNA。按照TaKaRa试剂盒步骤合成cDNA。通过荧光定量PCR对PPARγ，C/EBPα，FABP4和GAPDH的mRNA表达进行分析。反应体系包括cDNA 0.5 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ 10 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，ddH₂O 7.5 μL，总体积20 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35个循环。根据公式2-ΔΔC t计算PPARγ，C/EBPα，FABP4的相对表达量。

2.7 Western blot检测C3H10T1/2细胞成脂分化 诱导10 d后（同2.5项），收集各组细胞，加入适量的裂解液，放冰上裂解30 min，12 000 r·min^-1 4 ℃离心15 min，取上清得总蛋白，用BCA试剂盒对样品进行浓度测定；取40 μg蛋白样品上样到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以湿转法将蛋白印迹至硝酸纤维素膜上，以FABP4，PPARγ，C/EBPα和β-actin抗体4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1.5 h，化学发光液显影，凝胶电泳成像分析系统进行分析。以蛋白的灰度值/β-actin灰度值表示。

2.8 统计学处理 数据以±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。数据分析采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞增殖的影响 与空白组相比，高浓度的球松素查尔酮都能显著地降低C3H10T1/2细胞的增殖活性，而当其浓度较低时，几乎对C3H10T1/2细胞的增殖活性无影响。具体表现为：球松素查尔酮浓度≥60 μmol·L^-1时，能显著抑制细胞的增殖活性（P<0.05或P<0.01），且呈剂量依赖性。因此，在此基础上选择5，10，30，50 μmol·L^-1浓度进行后续实验，见图1。

3.2 球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响 不同浓度的球松素查尔酮处理C3H10T1/2细胞，成脂诱导10 d后，油红O染色观察。空白组几乎无油红O着色；诱导组被油红O染为鲜红色；球松素查尔酮30，50 μmol·L^-1组油红O染色较诱导组明显减少。这与酶标仪测定的吸光度分析结果较为一致，见图2和图3。

3.3 球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞成脂分化后甘油三酯含量的影响 不同浓度的球松素查尔酮处理C3H10T1/2细胞，成脂诱导10 d后，GAP-PAP酶法检测甘油三酯含量。由实验结果分析可知，与诱导组相比，球松素查尔酮50 μmol·L^-1组能显著降低细胞中甘油三酯的含量（P<0.05或P<0.01），见图4。

3.4 球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞成脂分化标志因子及关键转录因子mRNA表达的影响 与诱导组相比，球松素查尔酮50 μmol·L^-1组能显著降低成脂分化标志因子FABP4、关键转录因子PPARγ，C/EBPα mRNA的表达（P<0.01），见表2。

3.5 球松素查尔酮对C3H10T1/2细胞成脂分化标

志因子及关键转录因子蛋白表达的影响 与诱导组相比，球松素查尔酮50 μmol·L^-1组显著降低PPARγ和C/EBPα蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）；球松素查尔酮30，50 μmol·L^-1组显著降低FABP4蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）；从以上结果可得出，球松素查尔酮能够减少成脂关键转录因子PPARγ，C/EBPα和成脂分化标志因子FABP4蛋白的表达，见图5。

4 讨论

间充质干细胞在诱导分化为成熟脂肪细胞的过程中会受到诸多转录因子的多重调控，之后一系列脂肪组织特异性基因依次被激活表达，接着经过蛋白水平的复杂调控后分化为成熟脂肪细胞。在诱导分化过程中，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白（C/EBPs）是与成脂相关最主要的2类转录因子，它们在成脂分化过程中发挥着决定性作用。据文献报道，一些黄酮类药物能够通过激活ERK信号通路、抑制MAPK信号通路调控，抑制AKT的磷酸化来下调PPARγ和C/EBPα的表达达到抑制前脂肪细胞分化的效果[10]。杨蕾等人发现番石榴叶天然成分槲皮素-3-O-（6″-阿魏酸）-β-D-吡喃半乳糖苷能够剂量依赖性地抑制成脂分化，并且降低丝氨酸蛋白酶脂肪因子adipsin，CCTTA增强子结合蛋白C/EBPα和PPARγ mRNA及后两者蛋白表达[11]。

PPARγ被认为是脂肪细胞分化过程中必需的转录因子；若机体中缺少PPARγ，脂肪细胞内部的脂滴将无法积累，进而引发一系列脂营养不良的疾病，甚至会导致早期胚胎致死[12]；C/EBPs在脂肪细胞分化过程中是首个被证明具有重要作用的转录因子，具有特异性激活靶基因增强子CCAAT的功能[13]。研究表明，C/EBPα作为C/EBPs的亚型在成脂分化后期发挥作用，若缺失C/EBPα的小鼠出生后脂肪细胞会大量减少，最终死于低血糖。过表达C/EBPα基因会缩短3T3-L1前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞；相反，过低表达C/EBPα基因RNAi则会阻断此分化。在脂肪细胞分化过程中，C/EBPs和PPARγ家族成员均发挥至关重要的作用，它们相互协同，相互影响来激活与成脂分化相关基因的表达。成脂分化中的关键转录因子PPARγ在诱导因子的存在下被激活，并且表达增加。它能够进一步调节C/EBPα，ap2等成脂标志因子的表达。C/EBPβ和C/EBPδ作为早期调控因子最先表达，随后诱导PPARγ和C/EBPα表达而启动生成脂滴[14-16]。同时脂肪型脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein，FABP4）作為细胞成脂分化的标志物之一，后期表达极高。有研究表明超表达FABP4正调控3T3-L1脂肪细胞分化和脂质沉积，显著促进PPARγ，CEBPα的表达，而干扰FABP4则抑制PPARγ，CEBPα的表达[17]。在脂肪细胞分化过程中，PPARγ和C/EBPα均会出现一个逐渐上升的趋势[18-21]。谭佳宁等在研究小檗碱对C3H10T1/2细胞增殖与成脂分化的影响中发现，小檗碱能够显著下调C3H10T1/2细胞中PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA及FABP4 mRNA的表达抑制其细胞成脂分化，降低胞内甘油三酯含量[9]。高敏等发现白杨素能降低小鼠胚胎成纤维细胞中LPL及PPAR-γ2的转录水平，抑制小鼠间充质干细胞向脂肪细胞分化[22]。

本实验采用地塞米松和胰岛素及罗格列酮联合诱导的C3H10T1/2成脂分化模型研究山核桃叶总黄酮分离得到的球松素查尔酮对小鼠胚胎间充质干细胞成脂分化的影响。油红O染色显示球松素查尔酮可减少C3H10T1/2成脂分化中脂滴的数量。GAP-PAP酶法检测甘油三酯含量发现，与诱导组相比，球松素查尔酮50 μmol·L^-1组能显著降低细胞中甘油三酯的含量（P<0.05或P<0.01）。已有的研究表明，PPAR信号通路是影响细胞成脂分化的重要通路之一，在本实验的荧光定量PCR和Western blot的结果中显示，球松素查尔酮能降低PPARγ，C/EBPα和FABP4的基因和蛋白表达，从而抑制C3H10T1/2成脂分化。本实验为黄酮类药物在临床上用于治疗脂代谢相关疾病提供了理论依据，具有深远意义。

[参考文献]

[1] Bray G A， Bellanger T. Epidemiology， trends and morbidities of obesity and the metabolic syndrome [J]. Endoerine， 2006， 29（1）： 109.

[2] 吴雯，梁凯伦，陈波，等.桑叶提取物对食源性肥胖大鼠的减肥作用及机制研究[J].中国中药杂志，2017，42（9）：1757.

[3] Hao W， Dong J， Jiang M， et al. Enhanced bone formation in large segmental radial defects by combining adipose-derived stem cells expressing bone morphogenetic protein 2 with nHA/RHLC/PLA scaffold [J]. Int Orthop， 2010， 34（8）： 1341.

[4] Itoh T， Fairall L， Amin K， et al. Structural basis for the activation of PPARγ by oxidized fatty acids [J]. Nat Struct Mol Biol， 2008， 15（9）： 924.

[5] 朱学鑫，蒋瑞彬，黄晶晶，等.浙江不同产地山核桃叶主要黄酮苷元含量的比较研究[J].中华中医药学刊， 2015， 33（10）： 2351.

[6] 丁志山，钱朝东，黄燕芬，等.山核桃叶提取物在制备雌激素药物中的新用途：中国 104971089A[P]. 2015-10-14.

[7] Zhang T， Yamamoto N， Yamashita Y， et al. The chalcones cardamonin and flavokawain B inhibit the differentiation of preadipocytes to adipocytes by activating ERK [J]. Arch Biochem Biophys， 2014， 554： 44.

[8] 朱學鑫，蒋瑞彬，黄晶晶，等.大孔吸附树脂法富集山核桃叶球松素查尔酮工艺的研究[J].中华中医药学刊，2016，34（2）：304.

[9] 谭佳宁，陈宇驰，吕敏，等.小檗碱对C3H10T1/2细胞增殖与成脂分化的影响[J].中药材，2015，38（10）：2152.

[10] 王谦.沙棘籽渣中五种黄酮类化合物对脂代谢的调控及机理探究[D].上海：华东师范大学，2014.

[11] 杨蕾，李晓帆，张雅鸥，等.番石榴叶天然成分抑制3T3-L1细胞成脂分化的研究[J].中国药理学通报， 2011， 27（5）： 705.

[12] Berger J P， Akiyama T E， Meinke P T. PPARs： therapeutic targets for metabolic disease[J]. Trends Pharmacol Sci， 2005， 26（5）： 244.

[13] Rosen E D， Sarraf P， Troy A E， et al. PPAR gamma is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and

in vitro[J]. Moll Cell， 1999， 4（4）： 611.

[14] Obregon M J. Thyroid hormone and adipocyte differentiation [J]. Thyroid， 2008， 18（2）： 185.

[15] 王丽娟，于朝丽，章国永，等.抑制Hedgehog信号通路促进C3H10T1/2间充质干细胞成脂分化[J].中国生物化学与分子生物学报，2015，31（8）：843.

[16] 蒋金航，马云，王新庄. PPARγ基因调控脂肪细胞分化的研究进展[J].中国新畜牧杂志，2014，50（9）：91.

[17] Marks A. Histone deacetylase inhibitors： a chemical genetics approach to understanding cellular functions[J]. Biochim Biophys Acta， 2010， 1799（10/12）： 717.

[18] 马晶晶，章涛. PPARγ功能与疾病关系研究进展[J].中国药理学通报，2012，28（5）：601.

[19] Rosen E D， Hsu C H， Wang X， et al. C/EBPα induces adipogenesis through PPARγ： a unified pathway [J]. Gene Dev， 2012， 16（1）： 22.

[20] Vater C， Kasten P， Stiehler M. Culture media for the differentiationof mesenchymal stromal cells [J]. Acta Biomater， 2011， 7（2）： 463.

[21] Matsusue K， Peters J M， Gonzalez F J. PPARβ/δ potentiates PPARγ-stimulated adipocyte differentiation [J]. FASEB J， 2004，18（12）： 1477.

[22] 高敏，丁志山，水艳梅，等.白杨素抑制小鼠胚胎成纤维细胞成脂分化的作用研究[J].中国中药杂志， 2016， 41（1）： 106.

[责任编辑 张宁宁]