杨小体++汤晓艳++沈习习++张小庆

摘要 建立了高效液相色谱串联质谱（PLCM/M）法同时测定鸡蛋中头孢噻肟及其代谢物去乙酰头孢噻肟残留量的检测方法。样品经乙腈水（9∶1， V/V）提取，正己烷除脂，C18固相分散萃取除杂，Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×21 mm， 35 μm）分离，以02%（V/V）甲酸乙腈为流动相，进行梯度洗脱，目标物采用电喷雾正离子（EI+）模式电离，多反应监测（MRM）模式检测，基质匹配标准溶液外标法定量。结果表明，头孢噻肟和去乙酰头孢噻肟分别在10～1430 μg/L和10～1200 μg/L浓度范围内线性关系良好（R2>0999）。方法检出限（LOD， /N=3）分别为007和014 μg/kg，定量限（LOQ， /N=10）分别为023和099 μg/kg。 在50、500和1000 μg/kg 3个添加水平下，头孢噻肟和去乙酰头孢噻肟的回收率分别为831%～1030%和882%～1010%，相对标准偏差（RD， n=6）均介于20%～62%。实际样品测定结果表明，本方法简便、快速、灵敏、准确， 可用于鸡蛋中头孢噻肟及去乙酰头孢噻肟的残留分析检测。

关键词 鸡蛋； 头孢噻肟； 去乙酰头孢噻肟； 高效液相色谱串联质谱

1引 言

头孢噻肟（Cefotaxime， CX）为半合成的第三代人用头孢菌素，属于β内酰胺类抗生素，具有广谱、高效、耐酶等特点，被广泛应用于临床已有30余年。头孢噻肟在肝内代谢为有活性的去乙酰头孢噻肟和几种无活性的其它代谢物＼[1，2＼]。头孢噻肟及去乙酰头孢噻肟的分子结构式如图1所示。农业部176号公告＼[3＼]明文规定，未办理兽药、饲料添加剂审批手续的人用药品，不得直接用于饲料生产和饲养过程，而且头孢噻肟作为禁用药也在农业部第560号公告＼[4＼]中的兽药地方标准废止目录中。但由于头孢噻肟对兽医临床上常见的病原菌（如大肠杆菌、鸡鸭沙门氏菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌等）疗效突出＼[5～7＼]，近年被大量用于家禽饲养中，因而不可避免地残留在畜禽组织及其制品中＼[8，9＼]，造成食品安全隐患，同时也会加剧细菌耐药性的问题，给人类感染性疾病的预防和控制带来困难。随着该类药物的代谢机理、毒理和残留研究的不断深入，世界各国政府及有关国际组织已高度重视该类药物在动物性食品中的残留问题，对许多头孢类抗生素的残留量都制定了非常严格的要求。头孢噻肟由于过去很少兽用，目前欧盟、美国、日本以及我国均未对该药在动物中的残留限量做出相关规定。

为保障食品安全及人类健康，针对头孢噻肟在畜禽中滥用的现象，亟需对其进行有效的监管监测。头孢噻肟在机体内代谢迅速，不易检出，因而对于其代谢物的检测至关重要＼[10，11＼]。但目前报道的关于头孢噻肟的检测方法，如分光光度法＼[12＼]、高效毛细管电泳（PCE） ＼[13，14＼]、高效液相色谱（PLC）法＼[15＼]等，主要针对头孢噻肟原型，而对于其代谢物的研究仅有针对脑脊液、血浆等非食用性基质建立的高效液相色谱方法，且定量限大于100 μg/kg＼[16～18＼]，达不到动物源性食品残留检测的要求。本研究采用PLCM/M法建立了同时测定鸡蛋中头孢噻肟及其主要代谢物去乙酰头孢噻肟残留量的检测方法，并应用于阳性鸡蛋样品的检测分析。结果表明，本方法简便、快速、准确，可为头孢噻肟在动物源性食品中残留检测和生产监控提供技术支撑。

2实验部分

21仪器与试剂

1200 series高效液相色谱（美国Agilent echnologies公司）； QRAP5000三重四极杆质谱仪（美国AB ciex质谱系统公司）； Biofugetratos台式高速冷冻离心机（德国贺力氏公司）； LDCII型氮气浓缩仪（北京同泰联科技发展有限公司）； X105DM电子天平（瑞士Mettler oledo公司）； 培英ZP400振荡器（苏州市培英实验设备有限公司）； VOREX5涡旋振荡器（海门市其林贝尔有限公司）； MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）； 超声波清洗机（宁波新艺超声设备有限公司）。

头孢噻肟钠标准品（纯度≥995%，上海源叶生物科技有限公司）； 去乙酰头孢噻肟标准品（纯度≥98%，加拿大RC公司）； 甲醇（PLC级，德国Merck公司）； 乙腈（PLC级，美国JBaker公司）； 甲酸（PLC级，美国Mreda ecnology公司）； 实验用水为MilliQ纯水仪制备的超纯水（≥18 MΩ·cm）

22标准溶液的配制

以甲醇水（1∶1， V/V）为溶剂分别配制143 mg/L头孢噻肟钠和120 mg/L去乙酰头孢噻肟标准储备液，于棕色容量瓶中低温避光短期保存。测定当天用甲醇水（1∶1， V/V）逐級稀释至所需浓度，现配现用。

23样品处理

准确称取已混匀的全蛋样品（10±001） g，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈水（9∶1， V/V），涡旋30 s，振荡20 min提取，8000 r/min离心10 min，转移上清液至另一个50 mL离心管中，加入5 mL乙腈饱和正己烷除脂，涡旋30 s，振荡10 min，5000 r/min离心10 min，取下层溶液5 mL于10 mL离心管中，加入100 mg C18净化后，转移上清液于40℃以下水浴氮吹浓缩至干，以1 mL甲醇水（1∶1， V/V）复溶，经022 μm滤膜过滤后，待测。

24色谱条件

Agilent Eclipse C18色谱柱（100 mm×21 mm， 35 μm）； 流动相A为02% （V/V）甲酸溶液，流动相B为乙腈； 柱平衡时间1 min； 梯度洗脱程序：0～10 min，95% A； 10～30 min，95%～60% A； 30～50 min，60% A； 51～70 min，95% A； 流速03 mL/min； 进样体积5 μL； 外标法定量。

25质谱条件

离子源：电喷雾离子源（EI）； 检测方式：多重反应监测（MRM）； 扫描方式：正离子扫描； 碰撞气（CAD）压力为8 MPa； 气帘气（CMR）压力为35 MPa； 雾化气（G1）压力为55 MPa； 干燥气（G2）压力为55 MPa； 电喷雾电压（I）为5500 V； 离子化温度（EM）为550 ℃； MRM定量离子对、去簇电压（DP）及碰撞电压（CE）见表1。

3结果与讨论

31前处理方法优化

头孢类抗生素多采用不同浓度的甲酸水、乙腈水、甲醇作为提取剂＼[19＼]。本实验通过对比发现，乙腈水（9∶1， V/V）作为提取剂时，提取液清澈，蛋白质沉淀完全，回收率较高； 甲酸水作为提取剂的回收率相对较低，原因可能是头孢噻肟在酸性溶液中不稳定，氮吹水浴时分解所致。

QuEChER作为一种简单快速的样品前处理方法，近年被逐渐应用于β内酰胺类药物的前处理中＼[20＼]。鉴于动物组织中含有大量蛋白质和脂肪，应针对不同的样品基质，选择合适的提取溶剂和吸附剂。目前，动物源性食品常用C18和PA作为吸附剂吸附杂质，C18为非极性吸附剂，主要去除脂类和弱极性杂质； PA为弱阴离子交换剂，主要去除有机酸、金属离子和酚类等＼[21＼]。本实验考察了PA和C18对头孢噻肟钠及其主要代谢物去乙酰头孢噻肟的净化效果，结果表明，PA对目标物有吸附作用，而C18对头孢噻肟钠和去乙酰头孢噻肟几乎无吸附，净化效果较好，目标物回收率均在831%～1030%之间。此外，本实验也采用LiChrolut RP18柱和LB柱等传统的固相萃方式对鸡蛋样品进行了净化，发现去乙酰头孢噻肟回收率只有30%～40%，相比之下，QuEChER方法具有回收率高，简便快速，成本低廉等优点，更适用于大批量样品的残留检测。

32色谱质谱条件的选择与优化

在正离子模式下，头孢噻肟和去乙酰头孢噻肟主要以＼[M+＼]+分子离子峰形式存在，二级质谱图见图2和图3。质谱数据表明，以头孢噻肟的分子离子m/z 4561为母离子进行二级质谱分析，得到特征离子峰m/z 3961和 3241； 以去乙酰头孢噻肟的分子离子m/z 4141为母离子进行二级质谱分析，得到特征离子峰m/z 241和285； 其中m/z 241为β内酰胺环主要裂解碎片，且丰度最高，m/z 285为β内酰胺环较为特殊的开环方式＼[22＼]。

头孢类抗生素常用的流动相为水、甲酸溶液、乙酸铵溶液与乙腈、甲醇等＼[23～25＼]。本研究以Agilent Eclipse C18色谱柱（100 mm×21 mm， 35 μm）为分析柱。流动相的水相分别考察了纯水、01%和02%（V/V）的甲酸溶液、乙酸铵溶液（以甲酸调至p 45）； 有机相分别考察了乙腈、01%和02%（V/V）甲酸乙腈、甲醇，在同一色谱条件下对目标物进行梯度洗脱分离。结果表明，使用02%（V/V）甲酸乙腈作为流动相时，头孢噻肟钠和去乙酰头孢噻肟的峰形、分离度与灵敏度均优于上述其它流动相，结果如图4B所示，因此本研究选用02%（V/V）甲酸乙腈作为流动相。

实验表明，甲醇或纯水复溶效果均不理想，头孢噻肟钠和去乙酰头孢噻肟保留性差，峰形易受基质干扰。因此，本实验对不同比例的甲醇水的复溶效果也进行了考察，最后确定以甲醇水（1∶1， V/V）作为复溶液，目标物的出峰时间、分离度、峰型均能达到理想效果。

33方法检出限和定量限

分别以信噪比/N≥3及/N≥10确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），得到头孢噻肟和去乙酰头孢噻肟的检出限分别为007和014 μg/kg； 定量限分别为023和099 μg/kg。

34方法的线性范围、回收率和精密度

为了消除基质效应对测定结果的影响，本方法采用基质标准曲线对头孢噻肟和去乙酰头孢噻肟进行分析。准确吸取适量头孢噻肟钠和去乙酰头孢噻肟的混合标准溶液，分别加入到按23节方法处理过的空白样品提取液中，使溶液中头孢噻肟钠的浓度分别为1、6、36、72和144 μg/L，去乙酰头孢噻肟的浓度分别为1、10、30、60和120 μg/L，以峰面积和质量浓度作定量标准曲线。

取空白鸡蛋样品，分别添加5、50和100 μg/kg 3个水平浓度的头孢噻肟钠和去乙酰头孢噻肟混合标准溶液，每个浓度作6个平行样，按本方法测定回收率。线性方程、加标回收率及精密度如表2所示。

35实际样品分析

以头孢噻肟在蛋鸡养殖中的常用剂量20 mg/kg对实验蛋鸡连续5天肌注给药，并于停药后不同时间点采集鸡蛋样品，应用本方法测定其中头孢噻肟及去乙酰头孢噻肟的残留量。经检测分析，空白、加標样品和停药1 d后的鸡蛋样品LCM/M总离子流色谱图见图4。停药20天后，鸡蛋样品中仍可检测到头孢噻肟和去乙酰头孢噻肟，残留浓度分别为325和48 μg/kg，说明此药在鸡蛋中消除非常缓慢，因此，鸡蛋可作为蛋鸡养殖中监测头孢噻肟违规使用的靶组织。

4结 论

本研究建立了同时测定鸡蛋中头孢噻肟及其主要代谢物去乙酰头孢噻肟的高效液相色谱串联质谱（LCM/M）方法。本方法样品前处理简便快速，回收率高，定量限及精密度均能满足残留检测要求，解决了此药在动物组织由于残留低、易代谢转化而难于监测的问题，为此药在畜禽养殖中违禁使用的监管监测提供理论依据和技术支撑。

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