谢康，刘艳秋，阳彦，陆青，夏秋平

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，江西南昌330006)

母乳、小儿血液及尿液标本中检测巨细胞病毒对诊断小儿HCMV感染的临床应用

谢康，刘艳秋，阳彦，陆青，夏秋平

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，江西南昌330006)

目的探讨不同种类的标本中人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)的检测对诊断小儿感染HCMV的价值。方法采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，FQ-PCR）检测458例临床疑似HCMV感染的患儿尿液、血液和母乳中HCMV-DNA，运用化学发光发检测患儿血清HCMV-IgM抗体水平，并进行统计分析。结果458例患儿中，母乳HCMV-DNA的总检出率最高，达52.6%。新生儿组母乳HCMV-DNA阳性率（55.6%）明显高于尿液（7.0%）和单个核细胞（13. 4%），也远高于血清HCMV-IgM阳性率（4.2），差异均有统计学意义（P＜0.05）；婴儿组尿液HCMV-DNA检出率最高（59.8%），显著高于单个核细胞HCMV-DNA（24.3%）和血清HCMV-IgM（22.2%）的阳性率，但与母乳HCMV-DNA（51.3%）阳性率无明显差异（P＞0.05）。母乳HCMV-DNA与患儿尿液HCMV-DNA（r=0.778）、单个核细胞HCMV-DNA（r=0.395）及血清HCMVIgM（r=0.332）阳性率均呈显著正相关。结论根据年龄段选择HCMV的样本送检，对提高检出率具有重要价值，联合母乳、患儿尿液、单个核细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM检测可明显提高患儿HCMV感染检测的阳性率。

人类巨细胞病毒；小儿；实时荧光定量PCR；化学发光法；母乳

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一种属于具有双链DNA的疱疹类病毒，具有高度种属特异性和潜伏-活化的生物学特征[1]。该病毒在全球广泛流行，发达国家的感染率为30%～70%，我国人群的感染率在90%以上，尤以孕妇、婴幼儿等免疫功能低下的人群更为常见[2]。HCMV感染大多数表现为无症状的隐形或潜伏感染，该病毒是孕妇围生期感染的重要病原微生物之一，可通过胎盘、血液或者母乳等途径直接传播给婴儿，可导致胎儿畸形、流产、早产等，严重影响胎儿的健康；也可导致婴儿黄疸、肝脾肿大、皮肤出血点及淤斑等，重症病死率高，并可导致运动、听力、视力及智力等多种严重的后遗症[3，4]。因此，HCMV感染的早期诊断及预防显得尤其重要。

本研究运用实时荧光定量聚合酶链反应法（fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）检测疑似HCMV感染小儿血、尿及母乳中HCMV-DNA含量，同时采用化学发光法检测其血清HCMV-IgM水平，探讨不同种类的标本不同检测指标在小儿HCMV感染疾病中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2014年1月至2016年6月在江西省妇幼保健院疑似HCMV感染的住院患儿458例，年龄均≤1周岁，并按年龄分成两组。其中新生儿组（0≤年龄≤28d）共142例，男83例，女59例；婴儿组（29d≤年龄≤1周岁）共316例，男195例，女121例。

1.2 标本收集清洁患儿外阴，留取新鲜尿液2～5ml于干净无菌试管中；母乳采集用自我挤压法（不用吸奶器），清洁乳头后挤出乳汁5ml于干净无菌试管中，留取的标本立即送往实验室，如不能立即检测，标本置4℃冰箱中保存，24h内完成检测。同时抽取患儿静脉全血2ml（EDTA-K2抗凝）用于HCMV-DNA检测，促凝管采集静脉全血2ml用于HCMV-IgM检测。

1.3 标本处理乳汁、尿液标本：充分混匀后吸取1ml于无菌离心管中，12000r/min离心5min，弃上清，取沉淀。抗凝管标本：混匀后取EDTA抗凝全血1ml，沿试管壁缓慢加入装有淋巴细胞分离液的无菌试管中，1500r/min离心15min，吸取中间单个

1.4 试剂、仪器与样本检测FQ-PCR检测采用中山医科大学达安基因诊断公司CMV-DNA荧光定量试剂盒。实时荧光定量PCR扩增仪为美国ABI7500。上述标本处理后的母乳沉淀、尿液沉淀和单个核细胞沉淀分别加入DNA提取液混匀，100℃保温10min，12000r/min离心5min，取上清5μl作PCR反应。循环条件为93℃2min预变性，93℃45s→55℃60s→共10个循环，最后按93℃30s→55℃45s→共30个循环，于55℃45s末收集荧光信号。根据阳性定量参考品的CT值作标准曲线，通过样品的CT值计算DNA病毒载量，DNA拷贝数≥500copies/ml结果为阳性，DNA拷贝数＜500 copies/ml为阴性。HCMV IgM抗体检测试剂盒和全自动免疫分析仪Cobas E-601均购自德国罗氏诊断有限公司，且HCMV-IgM≥1.0COI(cutoff index)为阳性。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0软件处理数据，阳性率的比较采用χ2检验或Fisher’s确切概率法，阳性率相关性分析采用Spearman相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 458例疑似HCMV患儿中各种标本的阳性率比较如表1所见，458例疑似HCMV感染患儿中母乳标本HCMV-DNA的检出率最高（52.6%），显著高于单个核细胞HCMV-DNA（21.0%）及血清HCMV-IgM的检出率（16.6%）（P＜0.05），但与尿液HCMV-DNA的检出率（43.4%）无明显差异（P> 0.05）。

2.2 新生儿组四种检测标本HMCV阳性率的比较新生儿组中，142例疑似感染HCMV患儿的母乳标本中HCMV-DNA阳性率达55.6%，明显高于尿液（7.0%）、单个核细胞（13.4%）及血清中HCMVIgM的阳性率（4.2%），P值均小于0.01。单个核细胞HCMV-DNA阳性率均高于尿液HCMV-DNA与血清HCMV-IgM的阳性率（P＜0.05），而尿液HCMV-DNA与血清HCMV-IgM的阳性率无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.3 婴儿组四种检测标本HMCV阳性率的比较表1中可见，婴儿组中，316例疑似感染HCMV患儿的母乳HCMV-DNA阳性率与尿液HCMV-DNA阳性率差异无统计学意义，但均高于单个核细胞HCMV-DNA阳性率和血清HCMV-IgM的阳性率（P均小于0.01）。而后两者间的阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 新生儿组和婴儿组HCMV-DNA和HCMVIgM阳性率的比较表1中，除母乳HCMV-DNA阳性率差异无统计学意义外，新生儿组尿液HCMV-DNA、单个核细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM的阳性率均低于婴儿组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 HCMV-DNA与HCMV-IgM阳性率中的性别差异两组患儿中，男性与女性间的母乳、尿液、单个核细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM阳性率的差异均无统计学意义，P值均大于0.05（表1）。

表1 458例小儿疑似HCMV感染母乳、尿液、单个核细胞及血清检测情况

2.6 母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、单个核细胞HCMV-DNA阳性率及血清HCMV-IgM阳性率的相关性分析表2中可见，母乳检测中HCMVDNA阳性的共有241例，阴性217例，阳性率52.6%。其中，在患儿尿液HCMV-DNA阳性的199例中，母乳HCMV-DNA阳性共178例，占89.4%（178/199），患儿尿液HCMV-DNA阴性的259例中，母乳HCMV-DNA阳性共64例，占24.7%（64/ 259），两者差异显著（P＜0.01）；在患儿单个核细胞HCMV-DNA阳性的96例中，母乳HCMV-DNA阳性88例，占91.7%（88/96），患儿单个核细胞HCMV-DNA阴性的362例中，母乳HCMV-DNA阳性共151例，占41.7%（151/362），两者比较，P＜0.01，差异有统计学意义；在患儿血清HCMV-IgM阳性的76例中，母乳HCMV-DNA阳性67例，占88.2%（67/76），患儿血清HCMV-IgM阴性的382例中，母乳HCMV-DNA阳性共159例，占41.6%（159/382），两者比较，P＜0.01，差异有统计学意义。进一步进行Spearman等级相关分析得出，母乳HCMV-DNA阳性率与患儿尿液HCMV-DNA阳性率（r=0.788，P＜0.01）、单个核细胞HCMV-DNA阳性率(r=0.395，P＜0.01)及血清HCMV-IgM阳性率（r=0.332，P＜0.01）均呈正相关。

3 讨论

HCMV属疱疹病毒β亚科，为双链DNA病毒，又称为人类疱疹病毒5型，其直径约180～250 nm，在人群中感染十分普遍，尤其是孕妇、婴幼儿等免疫功能低下的人群[5]，然而婴幼儿感染HCMV早期很多无症状，呈隐形感染，将来有可能发展为智力低下，听力受损等中枢神经系统损害[6，7]。随着特异性抗CMV病毒更昔洛韦的应用，如何早期、快速而准确地诊断CMV感染成为监测CMV感染状态、给予合理的治疗及判断疗效、预后的关键。

表2 母乳HCMV-DNA与小儿尿液、单个核细胞HCMV-DNA及血清HCMV-IgM的相关性

目前，临床检测HCMV方法包括直接检查、血清学诊断、病毒培养、抗原检测、荧光定量PCR技术检测母乳、血、尿DNA含量[8，9]。本研究根据患儿年龄进行分组，分别检测新生儿组与婴儿组母乳、尿液、单个核细胞中HCMV-DNA含量及血清中HCMV-IgM水平，并进行结果分析。结果显示，458例疑似HCMV感染患儿中母乳标本HCMV-DNA的总阳性率高达52.6%，与国内文献报道结果相近[10]，推测HCMV感染母乳可能是小儿感染HCMV的主要途径之一。在新生儿组中，单个核细胞HCMV-DNA阳性率高于尿液HCMV-DNA和血清HCMV-IgM阳性率，差异统计学意义（P＜0.05），提示在新生儿疑似感染中同时检测其母乳及外周血单个核细胞HCMV-DNA含量可提高检出率，帮助早期诊断。HCMV最易侵犯肾脏等管道上皮细胞，并可在肾小球和肾小管上皮细胞内复制，随尿液排出，因此可在尿液中检测HCMV-DNA[11]。在婴儿组中，尿液HCMV-DNA阳性率最高，显著高于新生儿组，P＜0.01，这可能是与婴儿组相比，新生儿肾脏浓缩功能还不健全，尿液中病毒被稀释导致病毒含量非常低[12，13]，但具体机制还需进一步的研究。由此看来，在婴儿疑似感染HCMV中，联合检测母乳和婴儿尿液HCMV-DNA更有利于早期诊断。此研究为临床提供了参考，可根据疑似患儿的年龄选择送检标本，以提高检出率，达到早诊断早治疗的目的。

由于母乳营养成分全面且含丰富的免疫成分，适合小儿生长发育的需要并能降低婴儿感染感染性疾病的发生率。因此，母乳喂养一直被大力提倡。然而，近年研究发现母乳喂养是导致婴幼儿巨细胞病毒感染的流行病学的主要因素[14]。本研究发现，母乳HCMV-DNA阳性率与尿液、单个核细胞HCMV-DNA及血清HCMV-IgM阳性率均呈显著性正相关（表2），与国内报道基本一致[15]，提示患儿感染HCMV与母乳传播关系密切，证实了小儿HCMV感染可能来自母亲，提高孕妇孕产前的HCMV检查显得十分重要。

不同标本、不同检测方法均可对HCMV阳性结果造成影响。如表2所示，在母乳HCMV-DNA阳性的情况下，患儿尿液、单个核细胞HCMVDNA和血清HCMV-IgM均存在一定的阴性比例。其中，尿液HCMV-DNA假阴性可能与HCMV尿液间歇性排毒有关[16]，处于不排毒状态时检测的标本会产生与临床诊断不符合的现象，因此需反复、连续、多次检查尿液HCMV-DNA，以提高检出率。另外，人体感染HCMV后3～5d即可出现HCMVIgM抗体，其阳性是诊断早期感染的可靠指标，并表明为活动性感染，但HCMV-IgM抗体在血液仅存在3～6个月，临床实验室检测阳性率较低，并且由于免疫抑制效应，机体的免疫功能低下，新生儿和婴儿产生HCMV-IgM的能力较弱，导至出现假阴性。此外，类风湿因子、既往感染的残留和疱疹病毒属交叉反应均能造成假阳性，因此单一的HCMV-IgM指标对诊断HCMV感染并不可靠。联合母乳、尿液、单个核细胞HCMV-DNA和血清HCMV-IgM检测有助于患儿HCMV感染的辅助诊断。

综上所述，若患儿标本不易留取，应优先选择检出率高的标本，若条件允许，应同时留取血液、尿液及患儿母亲的乳汁，以提高HCMV的检出率，防止漏诊，以便及时给予抗病毒治疗，对降低疾病的严重性和死亡率至关重要。

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R373.9，R446.62

A

1674-1129(2017)03-0340-04

谢康，男，1982年生，学士学位，主管技师，医学检验/分子遗传学专业，主要从事人巨细胞病毒临床基因扩增检测、地中海贫血基因检测及产前诊断、Y染色体微缺失、SRY基因检测等研究工作。

刘艳秋，女，1964年生，教授，主任医师，主要从事妇产科、医学遗传学、产前诊断等研究工作。E-mail：ragexp@126.com核细胞层于离心管中，12000r/min离心5min，取沉淀。促凝管标本：于3000r/min离心5min，取血清。

2016-09-28；

2017-04-03)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.014