张 鑫 张晞文 丁 俊 孙学华 李 曼 周振华 高亚婷 金树根 高月求

(上海中医药大学附属曙光医院细胞免疫实验室，上海 201203)

实 验 研 究

灵猫方及其单味药醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原表达的影响※

张 鑫 张晞文1丁 俊1孙学华2李 曼 周振华 高亚婷 金树根 高月求△

(上海中医药大学附属曙光医院细胞免疫实验室，上海 201203)

目的 研究灵猫方及其单味药(牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿、猫爪草、生黄芪)醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达的影响。方法 制备灵猫方及其7种单味药的醇提物，分别配制成50、100、200、400 μg/mL 4个浓度，作用于HepG2.2.15细胞72 h，四甲基噻唑蓝(MTT)法检测药物的细胞毒性；酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg和HBeAg水平。结果 灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。牡丹皮醇提物、青皮醇提物、胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。猫人参醇提物、淫羊藿醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。结论 灵猫方醇提取物及组分的牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿醇提取物能抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达。

胞质，代谢；肝炎e抗原，乙型；肝炎表面抗原，乙型；灵猫方

乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致急慢性乙型肝炎、肝硬化、原发性肝癌的主要病因[1]，全球约有20亿人曾感染HBV，其中慢性HBV感染者有2.4亿[2]。目前抗HBV的西药主要有干扰素、核苷类药物如拉米夫定、恩替卡韦等，但治疗效果均不理想，且有一定的副作用，价格昂贵[3]。大量临床和实验研究证实中医药具有抗HBV疗效[4-5]，灵猫方是上海中医药大学附属曙光医院肝病科治疗慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB，以下简称乙肝)的有效验方，长期临床研究证实灵猫方具有保肝降酶、抗病毒作用[6-7]。我们通过体外实验，研究灵猫方及其组方中7种单味药的醇提物对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达的影响，以期明确灵猫方抗HBV的有效成分。

1 材料与方法

1.1 细胞株 HepG2.2.15细胞由上海市公共卫生临床中心惠赠。

1.2 主要试剂 DMEM培养液、胰蛋白酶(Trypsin)和胎牛血清(FBS)购自Life Technologies公司，四甲基噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich公司，酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。

1.3 实验药物 灵猫方药物组成：牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿、猫爪草、生黄芪，由上海中医药大学附属曙光医院中药房提供。灵猫方和单味药的醇提物由上海中医药大学中药研究所制备。醇提物溶于0.5% DMSO后加入10%FBS的DMEM培养液混匀、过滤，配制成50、100、200、400 μg/mL 4种浓度的含药培养液。

1.4 细胞培养 HepG2.2.15细胞以3.0×103细胞/孔接种于96孔板，每孔200 μL含10% FBS

的DMEM培养液培养，置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，分别换4种浓度的含药培养液培养72 h，同时设置无药物细胞对照组，收集上清和细胞作后续实验。

1.5 MTT法检测药物的细胞毒性 96孔板中每孔加入DMEM培养液90 μL和MTT溶液10 μL，37 ℃培养4 h，去上清，加入DMSO 150 μL后震荡10 min，自动酶标仪(570 nm波长)读取每孔的吸光度(OD值)，药物对细胞生长的抑制率(%)=(OD值对照组-OD值实验组)/OD值对照组×100%。按Reed-Muench法计算半数细胞毒浓度(TC50)[8-9]。TC50=Antilog[logB+(50-<50%抑制率)/(>50%抑制率-<50%抑制率)×C](注：B=<50%时的药物浓度，C=log稀释倍数)。

1.6 ELISA法检测药物对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用 按照ELISA试剂盒说明书检测每孔HBsAg和HBeAg的OD值。药物对HBsAg和HBeAg的抑制率=(OD值对照组-OD值实验组)/OD值对照组×100%。按Reed-Muench法计算半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)[8-9]。IC50=Antilog[logB+(50-<50%抑制率)/(>50%抑制率-<50%抑制率)×C](注：B=<50%时的药物浓度，C=log稀释倍数)；TI=TC50/IC50，TI>2为药物有效低毒，1

2 结 果

2.1 灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表1。

表1 灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

与灵猫方醇提物50 μg/mL比较，*P<0.05；与灵猫方醇提物100 μg/mL比较，△P<0.05；与灵猫方醇提物200 μg/mL比较，#P<0.05

由表1可见，灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞的TC50为2 551.77 μg/mL，对HBsAg和HBeAg表达抑制作用的IC50分别为188.80、48.30 μg/mL，TI分别为13.5、52.8，灵猫方醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。对HepG2.2.15细胞HBeAg的分泌无抑制作用(P>0.05)。

2.2 牡丹皮醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表2。

表2 牡丹皮醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

与牡丹皮醇提物50 μg/mL比较，*P<0.05；与牡丹皮醇提物100 μg/mL比较，△P<0.05；与牡丹皮醇提物200 μg/mL比较，#P<0.05

由表2可见，牡丹皮醇提物对HepG2.2.15细胞的TC50为456.26 μg/mL，对HBsAg和HBeAg表达抑制作用的IC50分别为291.88、119.94 μg/mL，TI分别为1.560、3.802，牡丹皮醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。2.3 青皮醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表3。

表3 青皮醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

与青皮醇提物50 μg/mL比较，*P<0.05；与青皮醇提物100 μg/mL比较，△P<0.05；与青皮醇提物200 μg/mL比较，#P<0.05

由表3可见，青皮醇提物对HepG2.2.15细胞的TC50为1 744.17 μg/mL，对HBsAg和HBeAg表达抑制作用的IC50分别为181.53、278.03 μg/mL，TI分别为9.6、6.3，青皮醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。2.4 胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表4。

表4 胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

与胡黄连醇提物50 μg/mL比较，*P<0.05；与胡黄连醇提物100 μg/mL比较，△P<0.05；与胡黄连醇提物200 μg/mL比较，#P<0.05

由表4可见，胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞的TC50为823.53 μg/mL，对HBsAg和 HBeAg表达抑制作用的IC50分别为286.29、384.32 μg/mL，TI分别为2.88、2.14，胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。2.5 猫人参醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表5。

由表5可见，猫人参醇提物对HepG2.2.15细胞的TC50为398.64 μg/mL，对HBsAg表达抑制作用的IC50为140.90 μg/mL，TI为2.829，猫人参醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。对HepG2.2.15细胞HBeAg的分泌无抑制作用(P>0.05)。

表5 猫人参醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

与猫人参醇提物50 μg/mL比较，*P<0.05；与猫人参醇提物100 μg/mL比较，△P<0.05；与猫人参醇提物200 μg/mL比较，#P<0.05；NA表示对HBeAg抑制率<50%，IC50未计算

2.6 淫羊藿醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表6。

表6 淫羊藿醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

与淫羊藿醇提物50 μg/mL比较，*P<0.05；与淫羊藿醇提物100 μg/mL比较，△P<0.05；与淫羊藿醇提物200μg/mL比较，#P<0.05；NA表示对HBeAg抑制率<50%，IC50未计算

由表6可见，淫羊藿醇提物对HepG2.2.15细胞的TC50为518.71 μg/mL，对HBsAg表达抑制作用的IC50为176.77 μg/mL，TI为2.93，淫羊藿醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌有抑制作用，且抑制率随药物浓度的递增而增加(P<0.05)。对HBeAg的分泌无抑制作用(P>0.05)。

2.7 猫爪草醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表7。

表7 猫爪草醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

NA表示对HBsAg和HBeAg抑制率<50%，TC50和IC50未计算

由表7可见，猫爪草醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制率<50%，提示其对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达无影响。

2.8 生黄芪醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响 见表8。

表8 生黄芪醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

NA表示对HBsAg和HBeAg抑制率<50%，TC50和IC50未计算

由表8可见，生黄芪醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的抑制率<50%，提示其对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达无影响。

3 讨 论

乙肝属中医学胁痛、黄疸、癥积、鼓胀等疾病范畴，主要病因是湿热或疫毒内感，而正气不足则为发病的内在条件。饮食不节(洁)、情志不和是本病的诱发因素。湿热疫毒，旷日持久，穷必及肾，表现为肾气亏损，湿热未尽。我们通过长期临床观察发现乙肝患者常见神疲乏力、头晕耳鸣、腰膝痠软、两胁隐痛、两目干涩、月经不调、阳萎遗精等肝肾不足症状，以及口干口苦、舌苔黄腻等湿热内蕴症状，首次提出以补肾为主、清化为辅的治疗原则，并结合现代药理研究和临床实践，创建了由猫爪草、猫人参、淫羊藿、牡丹皮、黄芪、胡黄连、青皮组成的灵猫方用于治疗乙肝[6-7]。猫爪草、猫人参皆入肝经，清肝泻火解毒，两药合用更增强清热解毒之功[10-11]；淫羊藿温肾壮阳[12]；青皮独入肝经，疏肝理气；牡丹皮清热凉血，活血解毒[13]；黄芪补中益气，利尿脱毒[14]；胡黄连清热燥湿解毒，利胆退黄[15]。本方补肾同时又充实肝体，改善肝脾之功，清热利湿。全方配伍精当，温而不燥，补而不滞，相辅相成，标本同治。

HepG2.2.15细胞模型是国内外公认和常用的体外评价抗HBV药物的细胞模型，能稳定持续分泌HBsAg、HBeAg。前期研究发现灵猫方药物血清能抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌[16]，但具体的有效单味药不明。因此，本研究提取灵猫方全方醇提物和该方各单味药醇提物，观察不同浓度的醇提物对HepG2.2.15细胞的细胞毒性及对HBsAg和HBeAg表达的影响。结果发现灵猫方及其单味药(牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿)醇提物对HepG2.2.15细胞无明显细胞毒性，且在此浓度下能抑制HBsAg和HBeAg表达，特别是灵猫方醇提物及牡丹皮、青皮和胡黄连醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达具有明显抑制作用，其治疗指数均>2，有效低毒，抑制率均随着药物浓度的增加而增加；猫人参和淫羊藿醇提物能抑制HepG2.2.15细胞HBsAg表达，其治疗指数均>2，有效低毒，且抑制率均随着药物浓度的增加而增加，但对HBeAg表达无抑制作用；猫爪草和生黄芪醇提物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg均无明显抑制作用。

本研究通过体外实验发现灵猫方及其单味药(牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿)醇提物能抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达，进一步在体外证实了灵猫方的抗病毒作用，并初步明确灵猫方中牡丹皮、青皮、胡黄连、猫人参、淫羊藿具有抗HBV的作用。由于该体外研究不能反映机体内在所特有的免疫调节和体内代谢对药物的影响，因此需要通过体内实验作进一步验证，以筛选出有效药物和成分，探索其作用机制。

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(本文编辑：习 沙)

Effects of Lingmao recipe and its single herb alcohol extract on the expression of hepatitis B surface antigen and e antigen in HepG2.2.15 cells

ZHANGXin*,ZHANGXiwen,DINGJun,etal.

*LaboratoryofCellularImmunity,ShuguangHospitalAffiliatedofShanghaiTraditionalChineseMedicineUniversity,Shanghai201203

Objective To study the effects of Lingmao recipe and its single herb alcohol extract (Cortex moutan, Green husk, Hu rhizoma coptidis, Cat ginseng, Epimedium, Catclaw buttercup root andAstragalus root) on hepatitis B surface antigen (HBsAg) and e antigen (HBeAg) in HepG2.2.15 cells. Methods Lingmao recipe and seven single herb alcohol extract were prepared, made into different concentration of 50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL and 400 mg/mL 4, on the HepG2.2.15 cells for 72 hrespectively.The cytotoxicity of drugs were tested by methylthiazol tetraztlium (MTT) method. The levels of HBsAg and HBeAg were tested by ELISA in supernatant of HepG2.2.15 cells.Results The alcohol extract of Lingmao recipehad inhibitory effect on the secretion of HBsAg in HepG2.2.15 cells, and the inhibitory rate increased with increasing drug concentrations (P<0.05). The alcohol extracts of Cortex moutan, Green husk and Hu rhizoma coptidis had inhibitory effecton the secretion of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells, and inhibition rate increased with increasing drug concentrations (P<0.05). The alcohol extracts of Cat ginseng and Epimedium had inhibitory effecton the secretion of HBsAg in HepG2.2.15 cells, and inhibition rate increased with increasing drug concentrations (P<0.05).Conclusion The alcohol extracts of Lingmao recipe and its components of Cortex moutan, Green husk, Hu rhizoma coptidis, Cat ginseng and Epimedium can inhibit the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cells.

Cytoplasm; Metabolism; HBeAg; Hepatitis B; HBsAg; Lingmao recipe

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.05.022

※ 项目来源：国家自然科学基金委员会资助项目(编号：81473477,81473629,81403351,81503545)；艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项(编号：2012ZX10005004-002)；上海市科委科技支撑项目(16401970600)；上海市进一步加快中医药事业发展三年行动计划(2014—2016年)项目(编号：ZY3-LCPT-1-1001,ZY3-CCCX-3-3027)；上海市科学技术委员会科研计划项目(编号：15YF1412300)；上海中医药大学预算内项目(自然科学类)(编号：2014YSN39)；上海申康医院发展中心临床科技创新项目(编号：SHDC12016121)

张鑫(1984—)，女，助理研究员，博士。从事慢性乙型病毒性肝炎免疫机制和中药干预研究。

R373.21；R394.114

A

1002-2619(2017)05-0729-06

2016-11-22)

△ 通讯作者：上海中医药大学附属曙光医院细胞免疫实验室，上海 201203

1 上海中医药大学附属曙光医院胰胆外科，上海 2012032 上海中医药大学附属曙光医院肝病科，上海 201203