曹慧婷+朱华旭+张启春+郭立玮

[摘要] 运用代谢组学方法研究黄连-黄芩药对对脑缺血模型大鼠代谢的作用机制。采用线栓法致大脑中动脉阻塞复制缺血再灌脑损伤大鼠模型（MCAO）。通过超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）的方法、Markerlynx软件、以及主成分分析法和偏最小二乘判别法分析正常大鼠、脑缺血模型大鼠以及分别给予黄连（HL）、黄芩（HQ）和黄连-黄芩药对（LQ）干预后大鼠尿液样本中的内源性代谢物的差异，结合内源性代谢物的一级及二级碎片离子的精确信息，检索并鉴定可能的生物标志物，进而在MetPA数据库中构建代谢通路。结果在脑缺血模型大鼠的尿液中发现并鉴定出了20种生物标志物，并对其相对含量及代谢途径进行分析。主要涉及神经递质调节、氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢等。这些代谢通路在脑缺血模型大鼠的体内发生紊乱，主成分分析表明，正常与脑缺血模型得到明显区分，而给予HL，HQ，LQ后可以使之向着正常状态转变。此研究对脑缺血大鼠代谢组及黄连-黄芩药对干预的作用机制进行阐释，体现代谢组学可反映生物体的生理及代谢状态，能较好地体现药对是中医遣方用药的特色优势，具有内在的组合变化规律以及中医药的整体观、系统观以及多成分协同或拮抗作用的特点。

[关键词] 脑缺血；黄连-黄芩药对；代谢组学；UPLC-Q-TOF/MS

[Abstract] The metabolic effect of Huanglian-Huangqin herb pairs on cerebral ischemia rats was studied by using metabolomic method. The rat model of ischemia reperfusion injury induced by introduction of transient middle cerebral artery occlusion （MCAO） followed by reperfusion. Ultra high performance liquid chromatography-series four pole time of flight mass spectrometry method（UPLC-Q-TOF/MS），Markerlynx software，and principal component analysis and partial least-squares discriminant analysis were used to analyze the different endogenous metabolites among the urine samples of sham rats，cerebral ischemia model rats，Huanglian groups （HL），Huangqin groups （HQ） and Huanglian-Huangqin herb pairs groups （LQ） was achieved，combined with accurate information about the endogenous metabolites level and secondary fragment ions，retrieval and identification of possible biological markers，metabolic pathway which build in MetPA database. The 20 potential biomarkers were found in the urine of rats with cerebral ischemia，which mainly involved in the neurotransmitter regulation，amino acid metabolism，energy metabolism，lipid metabolism and so on. Those metabolic pathways were disturbed in cerebral ischemia model rats，the principal component analysis showed that the normal and cerebral ischemia model is clearly distinguished，and the compound can be given to the normal state of change after HL，HQ，LQ administration. This study index the interpretation of cerebral ischemia rat metabolism group and mechanism，the embodiment of metabonomics can reflect the physiological and metabolic state，which can better reflect the traditional Chinese medicine as a whole view，system view and the features of multi ingredient synergistic or antagonistic effects.

[Key words] cerebral ischemia；Huanglian-Huangqin herb pairs；metabolomics；UPLC-Q-TOF/MS

药对是单味中药与若干方剂之间的桥梁，是许多方剂隐含的规律性特征与辨证施治内涵体现[1]。黄连和黄芩作为黄连解毒汤中的君药和臣药是其重要的组成部分，方中黄连与黄芩配伍比例为3∶2。黄连-黄芩属清热燥湿配伍的经典药对，两药配伍主治上、中二焦，火邪去而热毒清，均能清热燥湿、泻火解毒[2-3]。代谢组学是对一个生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析，从而描述生物内源性代谢物质的整体规律，并且将在内外因素作用下产生的代谢物质的动态变化与病理生理相关联。代谢组学处于生命信息传递的终端，它是能表现出生物体系整体功能或状态的最终结果而抛开体内复杂的生理过程的一种系统生物学科学[4-6]。本实验室前期研究黄连解毒汤在脑缺血模型大鼠体内药代动力学和药效学，探究其在体内的分布及代谢特点，寻找中药复方中蕴含的潜在规律和方证对应的合理性，结果黄连解毒汤中有效成分对脑缺血病症大鼠具有一定的调节作用。在此基础上本实验以大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occusion，MCAO）模型大鼠为研究对象，采用代谢组学技术、模式识别方法并结合代谢组网络数据库对大鼠尿液中代谢物进行研究，探讨正常与模型大鼠其尿液中的内源性代谢物的整体变化，分析鉴定潜在生物标志物及代谢通路，寻找黄连解毒汤干预后代谢产物动态变化规律及抗脑缺血的生物學作用机制。

1 材料

1.1 仪器与试剂 美国Waters UPLC AcquityTM系统；BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；SynaptTMQ -TOF质谱仪，配有Lock-spray接口，ESI离子源和MassLynx 4.1质谱工作站软件。 抗酸型冷冻离心浓缩仪（Labconco）；台式冷冻离心机（Thermo Fisher）；真空冷冻干燥仪（Biocool）。纯净水由南京易普易达纯水仪制得。乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Merck公司）；水合氯醛（成都科龙化工试剂厂，批号20160225）；叠氮钠（NaN₃，分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；TTC染色液（2%，南京迈博生物科技有限公司）。其他试剂均为分析纯。黄连、黄芩及黄连-黄芩药对水提液由实验室自制。

1.2 动物 SPF级SD大鼠35只，雄性，体重（250±20） g，购自浙江省实验动物中心，合格证号SCXK（浙）2014-0001。大鼠分笼饲养，饲养环境温度20～25 ℃，相对湿度55%～65%。

1.3 药材及样本制备 黄连（批号151203）、黄芩（批号151202），均购于安徽福春堂中药饮片有限公司，经南京中医药大学吴启南教授鉴定，符合2015年版《中国药典》规定。称取黄连、黄芩饮片各500 g，按黄连解毒汤中黄连与黄芩的比例（3∶2）称取药材饮片，混合，共500 g，分别水煎煮2次，第1次10倍量水，煎煮1.5 h；第2次8倍量水，煎煮1 h；水提取液合并、浓缩、真空冷冻干燥，得3组冻干粉，含生药分别为3.97，3.85，4.31 g·g^-1。精密称取一定量提取物置研钵中，加入少许0.5%的羧甲基纤维钠（CMC-Na）液，研磨后按照生药量浓度加0.5% CMC-Na液制成混悬液。

2 方法

2.1 动物模型复制 大鼠MCAO模型复制方法：大鼠10%水合氯醛腹腔注射（1 g·kg^-1）麻醉，躺位固定，用碘伏消毒皮肤，在颈部偏右方切口，钝性分离，分离右颈總动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）及颈外动脉（ECA）并挂线备用，结扎ECA，用动脉夹夹闭ICA远心端和CCA近心端后，迅速于分叉处下ECA上做一切口，从切口处插入MCAO线栓（直径为0.125 mm，距球端18 mm处作标记）。线插入ICA后，于入口处稍稍结扎线栓与入口处ICA段，至线栓插入深度为（18±0.5） mm左右。再次结扎入口处，线栓外留约1 cm，缝合皮肤。2 h后轻轻提拉所留线头至有阻力，实现大脑中动脉再灌，则造模完成。动物入选的标准（按照Zea Longa 5级评分法取评分为2，3，4分的动物）：动物于缺血2 h后出现对侧前肢倦曲、行走转圈或行走向对侧倒体征则纳入，动物无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。

2.2 动物分组和给药 实验动物按体重随机分为5组，每组7只，分为对照组（Sham）、模型组（MCAO）、黄连组（HL）、黄芩组（HQ）和黄连-黄芩药对组（LQ）。按照实验室前期做黄连解毒汤组给药剂量为生药20 g·kg^-1·d^-1换算相应剂量，灌胃体积2 mL· 100 g^-1。对照组和模型组灌胃给药等剂量的生理盐水，连续灌胃7 d。

2.3 TTC染色 将各组大鼠生理盐水、多聚甲醛灌注后取脑，-20 ℃速冻20 min后切片，37 ℃恒温TTC染色。

2.4 尿液样品的采集和处理 各组大鼠均于末次给药后连同正常组大鼠禁食不禁水，收集尿液12 h，接尿管中加1 mL 1%NaN₃为抑菌剂和防腐剂，收集的尿液于4 ℃离心机3 000 r·min^-1离心10 min后，取2 mL上清液-80 ℃冷冻保存至分析。分析前将尿液样品于室温解冻，解冻后精密吸取尿液200 μL，加入甲醇600 μL，涡旋振荡2 min，于4 ℃，13 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，37 ℃离心浓缩至干，残渣用200 μL 70%乙腈水溶液复溶，涡旋振荡2 min，于4 ℃，13 000 r ·min^-1离心10 min，取上清液用于进样检测。

2.5 色谱和质谱条件 色谱条件：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱： 0～1 min，95%A；1～13 min，95%～5%A；13～14 min，5%A；14～15 min，5%～95%A。柱温35 ℃，流速0.4 mL·min^-1，进样量2 μL。质谱条件： 毛细管电压3.0 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度350 ℃，锥孔电压45 V，离子能量1.0 V，锥孔气流量50 L·h^-1，脱溶剂流量600 L·h^-1，碰撞能量4 eV，扫描时间为0.5 s，间隔扫描时间为0.02 s。

2.6 代谢组学数据处理与分析 样品经过Waters公司的UPLC-Q-TOF/MS分析得到代谢指纹轮廓图谱。质谱数据采用Waters公司的MassLynx软件v4.1进行总离子流提取、峰对齐及归一化处理。主要参数包括：保留时间0～15 min；质荷比m/z 100～1 000（±0.01），峰强度阈值50，质量窗口0.05 Da，保留时间窗口0.20 min，自动检测5%峰高及噪声。利用MarkerLynx软件对峰面积、样品名称和离子强度组成的数据表进行分析。在进行多元变量分析前要对每个检测峰的离子强度进行标准化，即对原始变量进行Pareto标尺化处理。将处理后的数据按照“一种用于代谢组学数据处理中消除外源性成分干扰的分析方法”[7-8]，然后将剔除后的数据导入EZinfo 2.0进行有监督的偏最小二乘判别法（PLS-DA）进行分析。使用SPSS 16.0软件进行统计学处理，2组间比较采用t检验，检验标志性代谢物组间差异的显著性，显著性标准界值定为P<0.05。

3 结果

3.1 TTC染色 结果显示Sham组两侧大脑半球呈均匀一致红色，MCAO组见右侧纹状体及额顶叶皮质失染区呈白色，而且边缘清晰；HL，HQ，LQ组失染区范围均小于MCAO组，而且缘清晰，见图1。

3.2 大鼠尿液样品代谢指纹谱的建立和多变量数据分析 采用UPLC-Q-TOF/MS在正负离子模式下进行尿液样品的代谢分析，正负离子模式下对照组大鼠、脑缺血模型组大鼠、黄连组、黄芩组和黄连-黄芩药对组大鼠的典型总离子流图见图2。为了考察脑缺血模型大鼠体内代谢物的整体变化，采用PCA方法对正常组和模型组大鼠尿液代谢物谱数据进行模式识别，得到样品分布图，它能够反映样品之间的相似性、差异程度，图谱差异小的样品在散点图中的位置相互靠近；反之，差异较大的样品距离较远。所得的PLS-DA模型的R2Y和Q2分别为0.935和0.627，表明该模型是可靠的。A1，A2为模型组小鼠尿液代谢谱的分类，可以看出，在正、负离子模式下，脑缺血模型组与对照组得到明显区分，说明模型复制成功，与正常组相比脑缺血模型大鼠机体内发生代谢异常，见图3。

3.3 潜在生物标志物的鉴定通过 PLS-DA 分析，正常组、脑缺血模型组大鼠、黄连组、黄芩组和黄连-黄芩药对组的PLS-DA载荷图中的每一个点代表一个变量，变量对分类的重要程度（variable importance in the projection，VIP）由其值的大小来衡量，并依据VIP对变量进行筛选。VIP>1且具有统计学意义的变量被认为对模型有显著贡献。距离中心越远的点对差异的贡献度越大，越有可能是潜在的特征代谢物。

将潜在的生物标志物根据其质荷比及其串联质谱数据，在HMDB（http：//www.hmdb.ca/） 和KEGG （http：//www.genome.jp/kegg/） 公共数据库中进行检索和确认[8]，并与文献进行比较，共鉴定出 20个潜在的生物标志物，其质谱数据信息以及在对照组与脑缺血模型组大鼠尿液中的变化见表1。与正常组比较，模型组大鼠尿液中有变化的代谢物包括：L-乳酸、L-苏氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-犬尿氨酸、L-脯氨酸、牛磺酸、软脂酸、褪黑素、肌苷呈上调趋势，L-天冬酰胺、同型半胱氨酸、柠檬酸、硬脂酸、花生四烯酸、烟酰胺呈下降趋势。在给予黄连、黄芩及黄连-黄芩药对后，均有不同程度的回调现象，见图4，5。

3.4 代谢通路分析与干预机制探讨 将表1中的生物标志物输入MetPA（http：//www.metaboanalyst.ca/）数据库中，构建代谢通路。大脑中动脉栓塞（MCAO）所致脑缺血模型大鼠体内的代谢紊乱主要与8条代谢途径相关，见图6。在给予HL，HQ，LQ后，代谢物的含量得到一定程度的回调，代谢通路的紊乱有所改善，从代谢层面体现HL，HQ，LQ对脑缺血模型有较好的治疗作用。鉴定的20个生物标志物中，苯丙氨酸参与苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代谢，牛磺酸参与牛磺酸和亚牛磺酸代谢；花生四烯酸参与花生四烯酸代谢；柠檬酸参与乙醛酸和二羧酸代谢，烟酰胺参与烟碱和烟酰胺代谢；精氨酸、脯氨酸参与精氨酸和脯氨酸代谢，犬尿氨酸、褪黑素参与色氨酸代谢。

4 讨论

4.1 神经递质调节 γ-氨基丁酸（GABA）是一种抑制性神经递质，GABA代谢的改变可能是造成脑缺血引起的神经元损伤的一个重要因素[9]，在脑缺血损伤早期GABA水平急剧升高，使突觸后神经元处于保护性抑制状态，并可通过突触前抑制作用，减少谷氨酸的释放协助Ca²⁺等离子的转运，维持细胞内外渗透压[10] ，减轻细胞损伤，增强神经元对缺血的耐受性，缺血导致血脑屏障损害，大量GABA进入尿液，不能发挥神经保护作用[11]。郭昫等[12]采用此法造模给药后，测定大鼠丘脑中谷氨酸和γ-氨基丁酸含量，结果发现，黄连解毒汤药材总黄酮可以促进脑缺血模型大鼠丘脑中谷氨酸和GABA 含量恢复至正常水平。正常情况下，天冬氨酸 （Asp） 主要存在于神经末梢内的囊泡内，当末梢因膜去极化而兴奋时被释放到细胞间隙[13]。大脑局部缺血后，由于能量缺乏，从细胞内释放的谷氨酸数量增加，细胞外谷氨酸浓度迅速升高[14]。在给与黄连、黄芩、黄连-黄芩药对干预后，GABA、天冬氨酸含量下调，与文献报道一致。

4.2 氨基酸代谢 同型半胱氨酸是动脉粥样硬化、血栓栓塞、血管损伤的独立致病因素，并与脑缺血、冠状动脉疾病、类风湿关节炎及阿尔兹海默病等疾病高度相关[15]。甜菜碱（Met）可作为甲基供体，完成再甲基化的替代过程，在体内参与蛋氨酸循环，同型半胱氨酸含量升高可以在甜菜碱高半胱氨酸甲基

转移酶作用下利用Met提供的一个甲基转化为甲硫氨酸，导致肝代谢异常可能引起各种疾病，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑部肝部和血管病变[16]。牛磺酸（Tau）是脑内的一种抑制性氨基酸，具神经保护作用，脑缺血损伤时其胞外含量升高[16-17]，它可以调整脑内兴奋性氨基酸的含量。龙建飞等[18]采用MCAO模型大鼠为研究对象，结果表明黄连解毒汤水提取物、总生物碱总黄酮和总环烯醚萜可通过抑制神经元中Caspase-3 活性，保护缺血半暗带神经元。

4.3 能量代谢 乳酸是厌氧糖酵解的终产物，也是脑缺血/缺氧后，神经恢复有氧能量代谢的重要底物。脑缺血过程中，脑组织不能进行正常的有氧代谢，有氧呼吸受到抑制，能量代谢紊乱，无氧酵解加重，葡萄糖通过无氧酵解的方式产生少量ATP，同时，丙酮酸经乳酸脱氢酶（LDH）催化还原生成乳酸，乳酸含量上升[19-20]。张明发[21]发现黄连解毒汤中主要成分小檗碱可能有抗自由基作用，能增加整体小鼠耐缺氧能力，降低氧耗，并通过抑制腺许酸环化酶，对抗缺氧时儿茶酚胺释放过多所造成的组织耗氧增加。因而推测小檗碱通过抗缺氧，降低脑组织耗氧等途径抗氧自由基损伤。三羧酸循环（TCA）开端是在柠檬酸合成酶的催化下，草酰乙酸和乙酰辅酶A进行不可逆反应生成柠檬酸。三羧酸循环是细胞线粒体中重要的能量代谢途径，大脑缺血时，能量代谢失衡，三羧酸循环的相关代谢物发生应激性改变[22]。王月华等[23]观察小续命汤有效成分组对慢性缺血大鼠脑线粒体的作用。结果表明小续命汤有效成分组能够减轻缺血缺氧导致的线粒体功能异常及其结构损伤，降低缺血缺氧损害后导致的线粒体活性氧产生和凋亡。

4.4 脂质代谢 花生四烯酸（AA）是一种重要的人体必须脂肪酸，是人体前列腺素合成的重要前体物质，具有舒张血管、激活和抑制血小板聚集、参与造血和免疫调节[24]、诱导和抵抗致炎作用、调节神经内分泌和促进细胞分裂等[25] 。近年来研究表明，在病理状态下，花生四烯酸副产品可以阻塞星形胶质细胞的缝隙连接通道，进而增加神经元对氧化损伤的易感性。

4.5 激素调节 褪黑素（M）T是一种主要由松果体分泌的神经分泌激素，是高效的自由基清除剂和抗氧化剂[26]，并具有一定的抗炎作用，能够修复脑缺血引起的DNA损伤，减轻脑缺血时的微血管损害，保护线粒体功能及阻止细胞能量耗竭等。Stefanova N A等[27]发现长期服用褪黑素可显著减轻散发性阿尔茨海默病患者大脑中可能是神经元突触发生病变产生毒性Aβ-淀粉样蛋白积累的破坏作用。

5 结论

本研究采用代谢组学方法揭示了大脑中动脉阻塞所致的脑缺血模型大鼠与空白大鼠的内源性代谢产物的差异，并探讨了黄连-黄芩干预的作用机制。给予黄连-黄芩，对其内源性代谢产物具有较明显的调节作用，提示黄连、黄芩及黄连-黄芩药对可能能够一定程度的调整脑缺血所致的神经递质紊乱（天冬氨酸含量下降，γ-氨基丁酸含量升高）、能量代谢不足（葡萄糖、柠檬酸含量下降，乳酸含量上升）、氨基酸代谢异常（同型半胱氨酸含量下降，甜菜碱、牛磺酸含量升高）、脂质代谢异常（花生四烯酸含量下降）等。其可能涉及的作用机制主要有兴奋性氨基酸毒性；细胞信号转导（包括Ca²⁺超载和NO损伤）；线粒体损伤；氧自由基大量生成；星形胶质细胞和神经元网络等。现代药理学研究表明黄连解毒汤临床研究多集中在脑血管病变和精神系统疾病领域，临床上可用于抗脑缺血、抗氧化、降压等疾病。此外，代谢组学为模型动物体内代谢、循环状态的变化及药物可能的作用机制研究提供指导，并且它所反映的整体观念与中药整体思想和复杂体系的特点相吻合，对中药作用机制、方证對应依据、配伍规律等方面的研究提供技术支撑。

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[责任编辑 张燕]