谢晶+张丽+曾金祥+李敏+王娟+谢雄雄+钟国跃+罗光明+袁金斌+梁健

[摘要] 采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术快速分析鉴别短管兔耳草的化学成分，为其临床应用提供参考依据，试验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS仪器，YMC-Triart C₁₈色谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；质谱采用电喷雾（ESI）离子源，在负离子模式下采集数据，通过保留时间、精确分子离子峰和二级质谱裂解碎片，并结合参考文献，对短管兔耳草成分进行鉴定，该实验共鉴别出22个化合物，其中黄酮类化合物11个，苯乙醇苷类化合物6个，环烯醚萜类化合物1个，有机酸类化合物4个。UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能快速鉴别短管兔耳草中的各类化学成分，方法简单，快速，可为短管兔耳草的临床应用提供物质依据。

[关键词] 短管兔耳草；UPLC-Q-TOF-MS/MS；化学成分；快速鉴别

[Abstract] The chemical constituents of Lagotis brevituba were rapidly determined and analyzed by using ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS/MS） method，providing material basis for the clinical application of L. brevituba. The separation was performed on UPLC YMC-Triart C₁₈ （2.1 mm×100 mm，1.9 μm） column，with acetonitrile-water containing 0.2% formic acid as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL·min^-1 gradient elution and column temperature was 40 ℃，the injection volume was 2 μL. ESI ion source was used to ensure the data collected in a negative ion mode. The chemical components of L. brevituba were identified through retention time，exact relative molecular mass，cleavage fragments of MS/MS and reported data. The results showed that a total of 22 compounds were identified，including 11 flavones，6 phenylethanoid glycosides，1 iridoid glucosides，and 4 organic acid. The UPLC-Q-TOF-MS/MS method could fast identify the chemical components of L. brevituba，providing valuable information about L. brevituba for its clinical application.

[Key words] Lagotis brevituba；UPLC-Q-TOF-MS/MS；chemical constituents；fast identification

藏药是我国传统医药的重要组成部分，生长环境独特药用效能高，尤其对某些特殊疑难病症如风湿病、心血管病、胃病等方面显示出其他药物无可替代的作用[1]。这些特性说明藏药具有非常重要的开发价值。如何快速鉴别藏药化学成分，为药效活性提供参考依据是当前藏药进一步现代化开发与应用亟待解决的关键问题之一。

短管兔耳草系玄参科兔耳草属植物Lagotis brevituba Maxim的干燥全草，是著名藏药“洪连”的主要基原植物，也是2015年版《中国药典》收载仅有的9种藏药材之一。其应用历史悠久，在著名藏医古籍《月王药诊》、《四部医典》及《晶珠本草》中均有记载，并被《四部医典》列为藏草药之首，具有极高的药用价值。藏医学在临床上用于治疗肾炎、高血压、动脉粥样硬化症、全身发烧、肺病、湿热泻痢、阴道流黄黑色液物、综合性毒性中毒及“心热”等多种疾病。前期研究表明短管兔耳草具有抗炎[2]、抗癌[3]、抗阿爾茨海默病[4]、降尿酸[5]、抗肝损伤[6]等多种作用。这表明藏药短管兔耳草具有很好的开发与应用前景。物质基础的阐明是药物现代化开发的先决条件，因此如何快速阐明短管兔耳草化学成分，为临床药效提供物质依据，已成为其现代化开发的决定性因素。

目前短管兔耳草化学成分研究多采用传统分离纯化方法[7-8]。这些方法费时耗力，难以满足短管兔耳草化学成分快速鉴别的需要。近年来，液质联用技术集超高效液相色谱的快速高效分离能力和MS的高灵敏度、高选择性于一体，在中药领域应用日益广泛，已成为分离鉴定各种化合物的重要手段[9-10]。因此，本实验以藏药短管兔耳草为研究对象，应用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术对其甲醇提取物的化学成分进行研究，根据其准分子离子以及二级碎片离子、文献数据等鉴定短管兔耳草的化学成分，以为短管兔耳草临床应用及现代化开发提供支撑。

1 材料

岛津LC-30A超高效液相色谱仪，PDA紫外检测器；YMC-Triart C₁₈色谱柱（2.1 mm ×100 mm，1.9 μm）；Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪，配备 ESI 离子源及 Analyst 1.6 数据处理软件（美国AB Sciex公司）；KQ-5200DB型超声清洗机（昆山市超声波仪器公司）；AL204 型电子分析天平[Mettler Toledo 仪器（上海）有限公司]；Millipore-Simplicity 超纯水处理系统（德国默克密理博公司）；BUCHI电动旋蒸蒸发仪（瑞士步琪公司）。

大车前苷对照品（纯度≥98%，批号MUST-16041508）、 金丝桃苷对照品（纯度≥98%，批号MUST-16032113）、木犀草素对照品（纯度≥98%，批号MUST-16011015）均购自成都曼思特生物科技公司；毛蕊花糖苷（纯度≥97%，实验室自制）；松果菊苷（纯度≥98%，批号P23N7F25444）购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈（色谱纯，美国anaour公司），甲酸[色谱纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司]，其余试剂为分析纯。短管兔耳草购于成都荷花池药材市场，经钟国跃教授鉴定为短管兔耳草L.brevituba的干燥全草。

2 方法

2.1 供试品溶液制备

短管兔耳草全草粉碎，称取2.0 g，于锥形瓶中加入50 mL 75%甲醇超声提取30 min，重复3次。抽滤，旋干，用75%甲醇定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.2 标准品溶液的制备

分别精密称取对照品金丝桃苷2.18 mg、大车前苷2.33 mg、木犀草素2.24 mg、松果菊苷2.07 mg、毛蕊花糖苷2.45 mg分别置于5 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并稀释至刻度，分析前过0.22 μm微孔滤膜，备用。

2.3 LC-MS 条件

2.3.1 色谱条件 YMC-Triart C₁₈分析色谱柱 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流动相0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～5 min，5%～15% B；5～14 min，15%～16% B；14～28 min，16%～22% B；28～33 min，22%～95% B；流速0.4 mL·min^-1；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.3.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源（ESI），负离子模式；质量扫描范围m/z 50～1 200；喷雾电压-4 500 V；雾化气温度550 ℃；气帘气30 psi（1 psi=6.895 kPa），辅助气50 psi；去簇电压（DP）-100 V；采用AB analyst TF软件采集数据，TOF-MS一级预扫描和触发的二级扫描TOF-MS/MS离子累积时间分别为250，150 ms，碰撞能量CE 40 eV，CES碰撞能量叠加为（40±10） eV。

2.4 数据处理

采用AB Sciex公司Peakview 1.6数据处理软件对UPLC-Q-TOF-MS/MS采集的数据进行处理。

3 结果

3.1 短管兔耳草中化学成分确认

按照1.4.2项下方法对75%甲醇提取短管兔耳草药材成分进行定性分析，（-） ESI-MS 的质谱总离子流图（TIC）见图1。应用Peak View 1.6软件分析其中各化学成分的保留时间及其质谱信息，并结合其分子离子峰与对照品、文献报道的数据进行对比，再对其中的化学成分进行辨别，从而鉴定出短管兔耳草提取物中22个化合物，鉴定结果见表1。由于黄酮化合物在质谱中有相似的规律，其具有相同的母核，本次实验选择了具有代表性的化合物7，13，19，21详细分析其裂解过程，苯丙素类选择化合物9，10，15分析其裂解过程，有机酸类化合物选择化合物20分析其裂解过程。

3.2 黄酮苷元裂解规律以及其二级碎片离子

化合物7分子组成 C₂₁H₂₀O₁₂，母离子为m/z 463.100 8[M-H]-，相对分子质量为464。其脱去1分子吡喃半乳糖基得到m/z 301.012 4的碎片离子峰。继而脱去1分子CHO产生m/z 272.030 8，再脱去1个OH得到m/z 255.029 7的碎片离子峰，最后脱去1分子CO得到m/z 227.033 2的碎片离子峰[16]。与对照品金丝桃苷比较，发现其液相出峰时间与其相同，从而证明化合物7为金丝桃苷。

化合物13分子组成C₂₈H₂₈O₁₈，母离子为m/z 651.131 2[M-H]-，相对分子质量为652。二级碎片离子m/z 351.060 8显示双葡萄糖醛酸片段，母离子失去1个双葡萄糖醛酸片段得到m/z 299.057 9的碎片离子峰。其碎片离子峰推断为香叶木素苷元。苷元发生裂解失去1个CH₃得到m/z 284.035 7碎片离子。香叶木素苷元同时發生RDA裂解产生m/z 193.036 4和m/z 131.035 8黄酮特征碎片离子。根据文献[15]，推测化合物13为香叶木素-7-O-双葡萄糖醛酸苷。其裂解见图2。

化合物19分子组成 C₁₅H₁₀O₆，母离子为m/z 285.042 7[M-H]-，相对分子质量为286。二级碎片离子峰m/z 257.044 0为分子失去1分子CO，继续失去1分子CO产生m/z 229.052 0的碎片离子峰。同时母核发生RDA裂解分别产生m/z 150.999 3，133.058 2 的碎片离子，这2个碎片离子都是黄酮环裂解的特征离子，可以推断其为黄酮类化合物。其中m/z 133.025 4 的碎片离子为B环和C环中的残基组成的，所以其丰度远大于m/z 150.999 3的丰度[25-26]。之后又与对照品木犀草素进行比对，化合物19出峰时间与对照品相同，质谱裂解规律一致。从而确认化合物19为木犀草素。具体裂解过程见图3。

化合物21分子组成C₁₆H₁₂O₅，母离子m/z 283.059 6[M-H]-，相对分子质量为284。其裂解脱去甲基产生m/z 268.038 2的碎片离子峰，为基峰。该基峰离子继续发生裂解，脱去1分子CO生成m/z 240.042 0的碎片离子峰，继而丢失1个CHO产生m/z 211.038 2碎片离子峰。同时此化合物发生了RDA反应，产生m/z 151.000 3的黄酮特征碎片离子峰。根据文献[20]，推测化合物21为刺槐素。裂解方式见图4。

3.3 苯丙素类化合物裂解规律以及其二级碎片离子

化合物9的分子组成为C₂₉H₃₆O₁₆，母离子m/z 639.218 7[M-H]-，相对分子质量为640。二级碎片离子m/z 477.139 4推测为失去了1分子葡萄糖基或者是咖啡酰基，之后进行下一步裂解，产生m/z 315.112 5，表明化合物继续脱去1分子葡萄糖基或者咖啡酰基。m/z 297.101 2为m/z 477.139 4碎片离子脱去1个相对分子质量为180的中性碎片，其可能是咖啡酰基或者是端基六碳糖基同時失去了1分子的H₂O。而m/z 179.033 3又是m/z 297.101 2的互补离子。m/z 160.999 2则可能为剩下的咖啡酰基或者是葡萄糖残基脱氢离子。根据文献[17]，进行对比初步判断这个化合物为大车前苷，之后又与对照品进行比对，其出峰时间与大车前苷对照品相同，质谱裂解规律一致。最终确认化合物9为大车前苷。其裂解方式见图5。

化合物15分子组成为C₂₉H₃₆O₁₅，母离子为m/z 623.209 8[M-H]-，相对分子质量为624。质谱图中出现m/z 477.168 3碎片离子，可能为母离子失去末端的咖啡酞基或葡萄糖基产生的，但是丢失葡萄糖基需要断裂2个糖苷键，证实m/z 477.168 3为断裂末端咖啡酰基的可能性比较大。化合物继续发生裂解失去146，推测化合物继续失去1分子鼠李糖基。m/z 315.1188与m/z 135.0422相差180，说明该化合物丢失1个葡萄糖基。其中m/z 135，161为咖啡酰基苯乙醇苷的特征离子峰，其中m/z 161离子为强峰。根据文献[21]，可以推测它是毛蕊花糖苷。之后又与对照品相比较，其出峰时间与对照品出峰时间相同，质谱裂解途径一致，说明推断正确。毛蕊花糖苷裂解方式见图6。

化合物10分子组成为C₃₅H₄₆O₂₀，离子峰为m/z 785.287 5[M-H]-，相对分子质量为786。二级碎片离子m/z 623.243 2为准分子离子丢失1个葡萄糖基（C₆H₁₀O₅）产生的产物离子。之后继续丢失1分子咖啡酰基产生了m/z 461.178 4碎片离子。碎片m/z 623，461是松果菊苷的特征碎片离子。根据文献[18]，可以初步确定化合物10为松果菊苷，之后与对照品相比对发现其出峰时间与对照品相匹配，质谱裂解途径一致，说明推断正确。

3.4 环烯醚萜类化合物裂解规律以及其二级碎片离子

化合物18分子组成为C₂₄H₂₈O₁₁，母离子为m/z 491.163 1[M-H]-，相对分子质量为492。二级碎片离子峰m/z 315.109 3表明分子脱掉相对分子质量为176的肉桂酸基和1分子CO所产生的。m/z 175.040 2为脱去肉桂酸基，其后继续脱去1分子CO产生m/z 161.024 4的碎片离子，表示大基团发生碎片裂解之后产生了1分子脱氧葡萄糖基。根据文献[24]，可以推测化合物18为球花苦苷。其裂解过程见图7。

3.5 有机酸类物质裂解规律及其二级碎片离子

化合物20分子组成为C₁₈H₃₄0₅，母离子为m/z329.237 4[M-H]-，相对分子质量为330。碎片离子峰m/z 229.147 0为失去了1个C₆H₁₂O片段，随之继续失去了1分子H₂O生成m/z 211.136 3的碎片离子峰。之后分子脱去1个C₃H₄片段产生了m/z 171.104 6的碎片离子峰，再进行裂解丢失1分子CO₂产生m/z 127.113 5的碎片离子峰。经过文献[20]比对，化合物20可能为9，12，13-三羟基-10-十八碳烯酸或者是9，10，11-三羟基-12-十八碳烯酸，见图8。

4 讨论

短管兔耳草是重要的藏药材，具有多种药理活性，但其物质基础尚缺少研究。传统先提取分离纯化中药提取物，得到化合物单体之后再进行核磁共振波谱鉴定结构的成分分析方法操作复杂，工作量大。UPLC-Q-TOF-MS技术结合了超高效液相色谱的快速高分离能力和高分辨质谱的高灵敏度和高精确度，避免了传统成分分离分析方法的不足，不仅可快速对中药复杂成分进行定性分析，还具有操作简单、信息量大、节省溶剂的特点，因而在中草药成分研究中日益广泛[29]。

本试验应用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析了短管兔耳草甲醇提取物成分的质谱信息，快速成功鉴别了22个化合物，发现其中含有黄酮、苯乙醇苷、环烯醚萜、有机酸及萜等类多种成分。这些不同的成分具有不同的药效，如黄酮类化合物金丝桃苷具有抗炎、抗氧化、镇痛等活性[30]，木犀草素是抗肿瘤的启动因子，对直结肠癌细胞、鼻咽癌细胞、前列腺癌细胞、人乳腺癌等细胞增殖有显著的抑制作用，能增敏多种致凋亡因子，具有多靶点抗肿瘤的潜力[31]，木犀草素-7-O-葡萄糖苷能够保护心肌肉细胞[32]，苯乙醇苷类化合物毛蕊花糖苷具有抗高血压活性及XOD抑制活性等[33]，松果菊苷可以通过逆转线粒体功能及细胞凋亡、抗肿瘤坏死因子α诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡，从而促进血管性痴呆鼠脑中胆碱能神经递质水平等途径发挥明显的神经保护效应[34]，原儿茶酸具有抑菌抗炎，有抑制细胞凋亡等多种药理作用[35]，这些成分为短管兔耳草抗炎、抗高血压、抗肿瘤、抗阿尔茨默症等临床应用提供了较好的物质依据。这表明本试验推断出的化合物，在一定程度上阐明了短管兔耳草的药效物质，为短管兔耳草的临床应用及开发提供了初步物质依据。

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[责任编辑 曹阳阳]