姚令文+石岩+孙冬梅+程显隆+魏锋+马双成

[摘要] 建立了人工牛黄薄层指纹图谱，对其图像进行数字化和化学计量学研究。首先采用以环己烷-乙酸乙酯-乙酸-甲醇（2∶7∶1∶2）为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105 ℃加热至斑点清晰，并在366 nm下采集数码图像。然后将该图像转换成为灰度图像，得到指纹图谱的灰度曲线图多元数据，并采用主成分分析法对多元数据进行分析。结果表明薄层指纹图谱可表征不同生产企业生产的人工牛黄，并且分析得到图谱上表征来源的特征区域。该方法简便，快速，适合用于不同来源的人工牛黄质量差异的评价。

[关键词] 人工牛黄；薄层色谱；指纹图谱；胆汁酸；化学计量学；主成分分析

[Abstract] A method of thin-layer fingerprinting chromatogram of artificial cow-bezoar was established with the developing solvent consisting of cyclohexane，ethyl acetate，acetic acid and methanol （2∶7∶1∶2），and 10% sulfuric acid ethanol solution sprayed as colour-developing agent. After heated at 105 ℃，TLC was recorded as an image in ultraviolet light at 366 nm which was converted into grayscale. By the gray value extracted from the grayscale，the multivariate data obtained from TLC of samples could be analyzed by chemometric method. The results indicated that samples from different manufacturers could be distinguished by this method and some specific bands were found out. All in one，this simple and practical method was suitable for the evaluation of quality difference.

[Key words] artificial cow-bezoar；TLC；fingerprinting；bile acids；chemometrics；principle component analysis

人工牛黃是目前最常用的牛黄替代品，多用作成药复方的原料，据笔者统计，在《中国药典》2010年版一部中有近40个品种的成药配方中使用了人工牛黄，涉及国药生产准字文号达100余个[1]。人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工而成，具有清热解毒，化痰定惊之功效[2]。其生产企业较多，生产工艺和原料质量参差不齐，目前对其质量评价或控制的研究多为胆酸类和胆红素等成分的测定[3-12]，采用的方法也多为高效液相色谱法。本文在以上研究的基础之上，采用图像的灰度数字化分析方法对人工牛黄的薄层色谱图片进行处理，并使用化学计量学的信号处理技术及模式识别方法对其进行了进一步的处理以及分析，以期为人工牛黄的生产工艺的规范和质量控制的研究提供思路及参考。

1 材料

Camag Linomat 5型半自动点样仪（瑞士Camag公司）；Digistore 2数码成像系统（瑞士Camag公司）；ChemDataSolution软件（大连达硕信息技术有限公司）。

对照品猪去氧胆酸（批号100087-200610）、胆酸（批号100078-200414）、鹅去氧胆酸（批号110806-201105）、去氧胆酸（批号724-200207）、牛磺胆酸钠（批号110815-201309）均来自中国食品药品检定研究院；甘氨胆酸钠（批号：PSMEN-AS）来自东京TCI公司。供试品为5个生产企业，共19个批次人工牛黄样品（经检验均符合《中国药典》2015年版标准），见表1。薄层色谱硅胶G板（德国Merck公司）；环己烷、乙酸乙酯、乙酸、甲醇、乙醇、硫酸等试剂均为分析纯。

实验材料，见表1。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 分别取各供试品约0.1 mg，置于具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，超声提取10 min，过滤，即得。

2.2 薄层色谱条件 分别取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，条带状点样于薄层色谱硅胶G板，条带宽6 mm，间距5 mm。以环己烷-乙酸乙酯-乙酸-甲醇（2∶7∶1∶2）为展开剂展开，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105 ℃加热至斑点清晰，366 nm下用Digistore 2数码成像系统观测并采集数码图像，见图1。

2.3 薄层特征图谱的数字化 将366 nm下检视采集得到的数码图像进行灰度转化，对生成的灰度图像进行轨道划分以及背景选择，以比移值（Rf）为横坐标，以灰度值为纵坐标，即可得到各批样品的薄层色谱图像灰度值色谱数据，见图2。

2.4 数据的预处理 将以上所得数据导入ChemDataSolution进行平滑滤波处理，采用Savitzky-Golay法，窗口及多项式阶数分别选择9和2，平滑滤波前后见图3。

采用COW（correlation optimized warping）法对平滑滤波后的数据进行色谱峰峰位（薄层色谱斑点的比移值）的校准处理，参数segment Length和slack size分别选择16和5，见图4。

将原点（第1个至第38个变量）及前沿附近（第574个至第641个变量）的数据切除，选取第39个至第573个的变量作为待分析数据，见图5。

2.5 数据的分析 将经过2.4项处理所得的数据导入ChemDataSolution进行主成分分析，选取主成分数为7，累计方差情况及样品的第1和第2主成分得分分布见图6。

3 讨论

3.1 展开系统与检视条件的选择 由于人工牛黄中不仅含有游离型胆汁酸，还含有结合型胆汁酸[13]，这两种胆汁酸极性差异很大，较难保证在相同的薄层色谱中都位于适当的比移值范围（0.3～0.8），本研究所采用的展开系统可使人工牛黄中的胆汁酸类成分基本得到较适宜的分离，能够满足本研究所需的特征性研究。在本研究的基础之上，后续研究可以针对特征比移值范围相应地对展开系统进行调整。

由图1可明显的观察到，薄层硅胶板上胆汁酸类成分的斑点经硫酸显色后，可在日光、254 nm和366 nm下检视，不同胆汁酸类成分的斑点颜色存在一定的差异。通过这3种检视方法可分别检出人工牛黄样品薄层色谱中的6，7，8个斑点，可见366 nm下检视灵敏度最高，因此后续的数字化处理以及分析研究均是以366 nm下获得的色谱图为对象。

3.2 色谱斑点的指认 图1表明，根据对照品斑点定位，可指认出斑点b，e，g，h所对应的成分分别为牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、胆酸和猪去氧胆酸，而斑点i则为鹅去氧胆酸和去氧胆酸的混合斑点。对于斑点c，d，f来说，其成分还有待进一步研究。

3.3 图像数字化方法的设计 彩色图像是由红（R）、绿（G）、蓝（B）三原色通道在各个像素点呈现组合而成。RGB的每个通道都有256阶亮度，根据三通道亮度阶数可将彩色图像转换成为灰度图像，灰度值与RGB三通道亮度阶数均相关。如图2所示，根据这一原理可将样品复杂的TLC彩色图像转换成为简单的灰度图像，并从原点至前沿依次读取每个像素点的灰度值即可将其数字化。由于薄层色谱经常会出现背景干扰的情况，因此选择在每个展开轨道之间选取背景去除，以尽可能减小背景引起的误差。

值得一提的是，本文所采用的薄层色谱数字化的方法与薄层色谱扫描法所得结果具有本质的区别。薄层色谱扫描法是指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描[14]；而本文所采用的方法是基于薄层色谱的图像，采用的数字信号是源于图像本身的像素点的灰度强度。显然，本文研究方法采用的薄层色谱的数字信号与实验人员肉眼检视更具有一致性，但是对于实验人员的肉眼检视来讲，又具有一定的可量化性、可描述性以及分析便利性。

3.4 数据的预处理方法 原始数据存在噪音过大和色谱峰（薄层斑点）漂移的问题，无法直接进行分析。Savitzky-Golay法是Savitzky和Golay于20世纪60年代共同提出的，其原理是对数据中N个量测点进行多项式最小二乘拟合，该法既能有效提高数据信号的信噪比又能较好对有效信息进行保留，目前在分析化学信号预处理中被广泛的使用。对于信号峰漂移的问题，目前国际上最常用的方法有COW法、DTW（dynamic time warping）法、PWA（piecewise alignment）法和PTW（parametric time warping）法等，其中COW法最早由Nielsen等人开发[15]，目前在色谱信号校正工作中最为常用[16-17]。在本研究中首先采用了Savitzky-Golay法对原始数据进行滤波平滑处理，而后使用了COW法对色谱峰的漂移问题进行了修正，经过以上处理较好的解决了噪音误差问题以及色谱峰的漂移问题。此外，由于原点以及展开前沿在TLC色谱分析中意义不大，故将这两处数据变量除去之后做进一步的分析研究。

3.5 主成分分析結果 第1和第2主成分的累计方差贡献率尽管只有61.9%，但是这2个主成分却表征了不同来源（不同厂家）人工牛黄的薄层色谱的特征性差异，而第3个主成分则特征性差异的特点不明显，见图7。可见第1和第2主成分包含了薄层色谱数据中的大多数特征信息。其中第1主成分表征了生产企业A和C与生产企业B，D和E的产品差异特征，而第2主成分表征了生产企业C，E与生产企业A，B与生产企业D的产品差异特征。 主成分分析中的主成分是所有变量的线性组合，其指向及意义具有一定的抽象性，但是根据载荷图可判断主成分与变量之间的相关性进而会对变量特征性指认有所帮助见图8。横坐标为各变量，也就是薄层色谱图中由原点向展开前沿方向的各像素点，因此可将图8中的横坐标转换为实际的比移值，据此将图8中的相关变量转换为比移值后，可知比移值在0.14～0.23以及0.37～0.51的薄层色谱与第1主成分相关性最大，即存在较大的A和C与B，D和E的产品差异特征，同理可得到比移值在0.29～0.33以及0.85～0.90的薄层色谱与第2主成分相关性最大，即存在较大的C和E与A和B与D的产品差异特征。

4 结论

作为牛黄的替代品，人工牛黄处方是比较明确的，但经调查了解，各生产企业在生产过程中，具体工艺是严格保密的，各生产企业的原料的投料比例以及原料采购均有差异，因此客观上造成不同生产企业生产的人工牛黄客观存在一定的差异。笔者在之前研究中[13，18-21]曾因胆汁酸类物质的紫外吸收较弱而采用了柱前衍生以及蒸发光检测器等方法对胆汁酸类成分进行检测和研究，然而从定性角度对胆汁类药品进行质量控制以及评价来讲，薄层色谱法具有无可比拟的简便，快速、直观等特点。本研究表明不同来源样品的薄层色谱是存在一定规律性的差异的，并且按照本文的方法能够找到表征不同来源样品的特征比移值区域，希望本文能够对该品种药品的来源质量差异的研究提供一些参考。

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[责任编辑 丁广治]