胡淑荣+应光耀+胡玉莉+杨世海+杨美华

[摘要] 赭曲霉毒素A（OTA）是一类主要由曲霉属和青霉属等真菌产生的次级代谢产物，具有强烈的肾毒性，致畸、致癌、致突变等作用。研究表明OTA不仅广泛污染于食品饲料和农作物中，近年来在香辛料、甘草等中草药中也被证实广泛存在。鉴于OTA的普遍性和危害性，該文分别综述了可视化试纸条、流式微球技术、电化学传感器、表面增强拉曼光谱等技术在OTA快速检测上的应用，预期为实现OTA检测快速化、操作简单化、仪器小型化的高通量检测研究和应用提供参考。

[关键词] 赭曲霉毒素A；中药；快速检测方法

[Abstract] Ochratoxin A （OTA） is a toxic secondary metabolite mainly produced by Aspergillus and Penicillium species，with strong renal toxicity，teratogenic，carcinogenic，mutagenic effect. Studies have shown that OTA is not only widely contaminated in food and feed crops，but also has been widely contaminated in Chinese herbal medicines such as spices，licorice and so on. In view of OTA′s universality and harmfulness，this paper summarizes the flow visualization test strip，microsphere，electrochemical sensor，surface enhanced Raman spectroscopy technology in OTA rapid detection，which provides reference for the research and application of high throughout detection instrument miniaturization in order to achieve OTA quick detection and simple operation.

[Key words] ochratoxin A；Chinese medicine；rapid detection method

随着中药材出口逐年增加，我国中药材的安全问题也受到了全世界的广泛关注。中药材安全问题除了其自身的内源性毒素，例如川乌中的乌头碱、雷公藤中的雷公藤碱等外，真菌毒素、农药、重金属这3大主要外源性污染物也严重威胁着中药材的安全性和品质。由于中药材本身营养成分丰富和外部环境的影响，在种植、采收、加工、运输和储藏过程中操作不当极易污染真菌，进而产生各种真菌毒素[1]。

真菌毒素是由真菌产生的次级代谢产物，种类繁多，包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮等，其中赭曲霉毒素A（OTA）是由二氢异香豆素以酰胺键结合1个苯丙氨酸形成的苯基氨酰衍生物，是赭曲霉毒素系列中毒性最强的真菌毒素，在二氢异香豆素环上的氯原子可以增强毒性，脱氯的赭曲霉毒素B（OTB）其毒性要比OTA小10倍。OTA主要由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉产生，不仅具有致癌、致畸和致突变作用，还具有肝肾毒性、免疫毒性等，而且化学性质稳定，只有在250 ℃以上温度加热数分钟才能降低OTA的浓度，已被国际癌症研究中心（IARC）定义为Ⅱ类致癌物质，这严重影响了中药的质量和疗效，对人类健康造成极大威胁，也阻碍其进出口贸易和中药国际化和现代化进程，如欧盟规定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黄及其混合物中OTA的限量为15 μg·kg^-1，甘草根的浸渍物中OTA 限量为20 μg·kg^-1，中国台湾对婴儿食品中OTA的限量标准为不得检出[2-6]。

1 中药中赭曲霉毒素污染现状

中药大多来源于自然界中的植物和动物，而产赭曲霉毒素A的霉菌在自然界中具有广泛性。因此，中药也容易受到这些霉菌的侵害。近年来随着中药在疾病预防与治疗、保健品、食品开发等方面重要性的提高，中药中真菌毒素的污染也备受关注。为了保障中药、保健品和食品等安全及人体健康，世界各国及相关组织十分重视真菌毒素的检测及其污染的控制。我国中药材品种繁多，资源丰富，就药典收录的品种就有2 000余种，种植和加工技术有很大的差别，成分基质复杂。近几年文献报道，OTA污染主要集中在根及根茎类、种子果实类和芳香植物中等[7-12]，见表1。

2 基于抗体的快速检测方法

基于抗体的快速检测是以抗体抗原免疫化学反应为基础，对抗体抗原含量进行测定的一种方法，具有高度的特异性、灵敏度和快速简便等优点。OTA相对分子质量为403.82，属于半抗原，抗原性较弱，在免疫反应中，只具有反应原性而不具有免疫原性，因此只有与蛋白质等大分子物质结合后，才具有免疫原性[13]。

2.1 胶体金免疫色谱技术 胶体金免疫色谱技术（gold immunochromatography assay，GICA）是1种将单克隆抗体技术、胶体金标记技术和免疫检测技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。OTA快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的方法，从加样处开始分别为样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸。对金标垫用处理液进行处理然后喷上金标抗体进行偶联，NC膜的检测线（T线）为偶联了BSA的OTA和控制线（C线）为羊抗鼠的二抗。

赖卫华等[14]应用竞争抑制免疫层析的方法，研制出了1种用于快速检测赭曲霉毒素A的胶体金试纸条，其检测限为10 μg·L^-1，检测时间为10 min。该实验的结果研究表明，赭曲霉毒素A的结构类似物赭曲霉毒素B，桔霉素与赭曲霉毒素A快速检测试纸条不产生交叉反应，表明赭曲霉毒素A快速检测试纸条具有较好的特异性。目前该方法由于具有快速、操作简单、检测时间短等特点，可用于大批次样品的检测，其在食品和中药中的检测会得到充分发展和广阔应用。

2.2 流式微球技术 流式微球技术是将荧光编码微球与流式细胞仪相结合的新型技术，该技术可以实现高通量同时分析样品中的多种待测目标，现今已广泛应用于食品、农产品和环境等领域的快速检测，尤其是小分子物质包括农药和真菌毒素的高通量多目标的快速检测[15-18]。

肖昌彬等[19]利用流式微球技术检测中药麦芽中的OTA含量，其将荧光编码微球与牛血清白蛋白-OTA（BSA-OTA）偶联形成微球-蛋白包被抗原偶联物，将简单前处理后的麦芽样品加入到复合物溶液后，使样品中的OTA与微球-蛋白包被抗原偶联物共同竞争OTA特异性识别的生物素修饰单克隆抗体，加入荧光探针（异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠二抗，FITC-IgG）孵育1 h后，采用流式细胞仪检测微球表面的平均荧光强度，从而实现麦芽中OTA的定性和定量检测。该方法检出限能达到0.12 μg·L^-1，基质干扰小，加样回收率在93.9%～97.4%，RSD小于3.6%，且线性良好，R²0.989 2。16批实际麦芽样品中，检测到2个阳性样品，最高量3.83 μg·kg^-1，且与LC-MS-MS的确证结果一致。该技术与其他分析方法相对比，每次检测所需试剂少，样品消耗量低，因此检测成本也较低[20]，对于中药材中赭曲霉毒素A或其他同类真菌毒素的快速检测具有巨大前景。

2.3 电阻抗免疫传感器技术 生物传感器技术是由多学科领域交叉的产物，当利用该技术进行物质检测时，待测物经扩散作用进入生物活性材料中，通过与识别元件或感受器（如：酶、抗体、适配体等）发生生物化学反应并产生变化，利用物理和化学转换器（如：氧电极、光敏管等）和电子放大器将该变化转化成可定量处理的声、光、电等信号，通过一系列标准曲线，就可以精确测量出待测物质的浓度[21]。虽然光学分析方法的研究相对比较热门，但是由于电化学分析方法不受样品颜色、澄清度等影响，只需要简单的前处理过程即可实现对目标物质的分析检测，而且所需的仪器设备简单，如电化学工作站，因其价格低廉、操作简单、检测装置轻便易携带、检测快速且灵敏度高、易于微型化和集成化的特性，国内外环境工作者将其广泛应用于水体中重金属的检测当中[22-23]。

根据检测信号类型不同，电化学免疫传感器可分为电流型、电位型、电导型和阻抗型。由于生物体和生物反应的电特性，例如抗体和抗原发生反应后会引起电极间介质的阻抗发生变化，从而通过测量阻抗变化值来实现对目标分析物的检测。Francesca等[24]开发了用于定量测定赭曲霉毒素A（OTA）的一次性丝网印刷碳电极（SPCE）上的阻抗标记免疫传感器。在用金纳米颗粒（AuNP）修饰SPCE表面后，通过半胱胺层将抗-OTA固定在工作电极上。在每個涂覆步骤之后，通过循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）表征改性表面。选择电容作为在不同OTA浓度下电极表面的电性质的可再现的变化的最佳参数，并且其用于研究所开发的免疫传感器的分析参数。在优化条件下免疫传感器之间的线性关系为0.3～20 μg·L^-1，检测下限为0.25 μg·L^-1，适合许多常见食品中的OTA含量检测。该方法同时用于测量红葡萄酒样品中的OTA，并将结果与用竞争性ELISA试剂盒结果进行比较。结果显示免疫传感器对低于2 μg·kg^-1的OTA较敏感，符合欧洲法规中对常见产品食品所建立的OTA限量标准。

由于免疫的快速检测方法大多数是基于免疫竞争的原理，因此所需的抗体数量大，如今多数抗体筛选和制备技术多是在生理条件下进行，从小鼠到家兔，甚至是羊驼和骆驼等大型动物都被用于免疫和制备相应的抗体，因此该技术最大的难点就是制备时间长、费用高、具有不稳定性。此外抗体本身化学性质不稳定，容易受温度、pH等影响，发生不可逆的变性，而且与结构类似物的交叉反应较多，受复杂基质如中药材等的干扰大，容易出现假阳性的结果，灵敏度也受所制备的抗体的亲和力限制，这些不足之处均影响了以抗体为基础的检测技术和方法的推广和应用[25-27]，见表2。

3 基于适配体的快速检测方法

核酸适配体是经指数富集的配体系统进化（SELEX）技术在体外化学合成并通过层层筛选得到的单链寡核苷酸片段，一般由数10个核苷酸组成，可以是RNA或者单链DNA[28]。适配体可结合物质范围广泛，不仅可以和酶、蛋白质等大分子结合，也能与氨基酸、激素、真菌毒素、农药，甚至是重金属元素等生物或化学小分子产生高特异性、高亲和力的结合[29]。其高亲和力结合主要在于适配体能与各种靶物质通过分子间作用力形成更加稳定的三维空间结构且与靶分子结合空间位阻小，因此稳定性好，不易受到环境中的核酸酶、酸碱性物质和有机试剂的影响[30]。Cruz-Aguado和Penner[31]首次筛选出OTA的核酸适配体，不仅为食品、粮食和饲料中OTA的分析检测带来便利，也为中药材快速检测OTA起到了铺垫作用。

3.1 胶体金适配体试纸条技术 胶体金适配体试纸条技术原理与胶体金免疫试纸条类似，均由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、测试线（T线）、质控线（C线）、PVC底板和吸水垫组成，结构见图1。在结合垫上，3′-端经巯基修饰的OTA适配体与胶体金通过Au-S键合形成稳定的金标探针，T线上包含一段与OTA适配体互补的核酸片段，并用生物素进行修饰，C线上包含一段含胸腺嘧啶的核酸片段，用生物素进行修饰，能与OTA适配体结合。当中药样品溶液滴在样品垫中后，由于毛细管作用，样品溶液沿着试纸条流动，倘若样品中存在OTA，OTA将与结合垫中的金标探针结合，根据竞争法的原理，T线则不显色，而C线显色，若样品中无OTA，则T线和C线均显色。

Zhou等[32]采用基于适配体技术的胶体金试纸条应用于中药黄芪中OTA的检测发现，胶体金特征、大小、胶体金-适配体结合物的数量、迁移速率和甲醇的量都会影响试纸条的检测灵敏度。最终优化后发现，将胶体金-适配体结合物浓度稀释4倍后最终呈现出明显的颜色变化，通过调节运行缓冲液成分和比例、膜类型和封闭缓冲液的成分和比例，从而优化出最佳迁移速率，在缩短检测时间的同时也提高了检测灵敏度。此外，还发现甲醇浓度超过20%后会影响金标探针的释放直接导致显色效果。研发的胶体金适配体测流试纸条检测OTA的检测限为1 μg·L^-1，检测用时为15 min，且与同类毒素无交叉反应。当检测9个黄芪样品时发现有1个阳性样品，结果与液质联用的方法一致。虽然试纸条上的颜色深浅与OTA的含量成反比，且检测耗时少，但仍是1种半定量的方法，倘若在胶体金材料中引入荧光物质，或将发光材料以夹心法的方式与胶体金和适配体连接，结合可以读取荧光强度的设备，就可以精确快速定量中药材中OTA的含量，进行现场快筛。

3.2 电化学适配体传感器技术 在适配体技术的基础上，为了满足复杂样品如食品、饲料和中药材中痕量目标物如农药、真菌毒素等检测需求，就要寻找到提高检测灵敏度的信号放大方法。由于金属纳米粒子含有大量的金属离子，并且可以通过电化学的方法检测出来，根据这一特性可以将金属纳米粒子作为放大检测信号的信号分子，选择具有良好生物亲和性纳米材料作为基底或母体（如SiO₂纳米粒子等），将多个活化后的另一种纳米材料（如CdS量子点、磁微球等）装载在经修饰后的基底上形成复合型纳米材料，然后与sDNA反应后形成纳米信号探针，将cDNA与金电极自组装形成捕获探针，将两者相结合形成电化学生物传感器，利用免疫竞争原理和电化学工作站进行检测，就可以定性定量检测超低含量的目标物，如食品、粮食和中药材中的赭曲霉毒素A[33-35]。

在生物传感器的领域中，由于纳米材料的介入，借助其在光学、电学、磁学和化学活性等性能上的独特表现，使本身就基于纳米级别分子运作的生物传感器能够更好的在小分子化合物检测上如虎添翼[36]。Bonel等[37]将OTA特异性的适配体与磁微球反应孵化成功能化的磁球，利用磁场的磁力将修饰过的磁微球固定于丝网印刷电极上，辣根过氧化物酶-OTA结合物与供试溶液中游离的OTA产生竞争反应，反应的产物采用差示脉冲伏安法来测定，该方法在检测OTA上线性范围广，在0.78～8.74 μg·L^-1，且检测限能达到0.007 μg·L^-1，在实际样品小麦中检测OTA含量，其结果的RSD小于8%，专属性强，与同类毒素也不发生交叉反应。

3.3 表面增强拉曼光谱技术 表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技术是基于拉曼散射效应，将待测分子吸附在某些经特殊化修饰、具有纳米结构特性的金属表面上，从而增强其拉曼散射效应的分子振动光谱技术[38]。该技术不仅能提供待测分子的详细结构信息，而且对待测物的检测限理论上能达到单分子的水平，比常规的拉曼技术的灵敏度高出数个数量级，从而能实现对痕量物质，尤其是中药材中的真菌毒素（如赭曲霉毒素A等）的快速定量检测。为了减少复杂的基质效应，SERS的应用主要是将贵金属纳米粒（如纳米金颗粒、纳米银颗粒等）与信标寡核苷酸单链相结合，将该结合物作为SERS的信号增强基底，从而实现食品等基质中有害小分子物质和真菌毒素的高灵敏检测[39-42]。

Ganbold等[43]用Cy5荧光染料标记OTA适配体，并吸附于纳米银颗粒表面，增强了拉曼光谱信号，当环境体系中存在OTA时，就会与适配体结合发生结构转变，并使原先Cy5-OTA与纳米银颗粒之间的化学键断裂，从而使拉曼光谱的信号强度下降。在浓度0.1～10 nmol·L^-1，随着OTA浓度的上升，拉曼光谱的信号强度可以下降到40%。此外他们还采用杀鼠灵作为对照组来验证该方法的抗干扰能力，结果证明杀鼠灵不会干扰表面增强拉曼光谱的信号及强度。该方法的检测限极低，能达到0.1 nmol·L^-1的水平，只需要极少的样品量和极短的检测时间（30 s）就可测得OTA的含量，因此，这在中药材中OTA的现场实时快速检测具有很大的应用前景。

此外，表面增强拉曼光谱技术为中医药成分的鉴定提供了一种更为准确、客观、直接的鉴定手段。李宁等[44]将表面拉曼光谱技术与其他检测手段和数据处理方法结合后成功鉴别出了单味中医药的成分、产地以及真伪，在中医药煎剂成分的鉴定中也体现出了其优越性。表面增强拉曼光谱技术作为一种新的鉴定手段，在中医药鉴定方面有着巨大的潜力，有望成为中医药鉴定的另一强大工具，见表3。

4 其他快速检测方法

近红外光谱成像（near-infrared hyperspectral imaging）是一种现代光谱技术，是将现代电子技术、光谱分析技术、计算机技术和化学计量学技术相互结合的集合体[45]。近红外光谱成像是近年来发展起来的一种新的分析手段，特别是在分析化学成分和污染物的空间分布测定方面，近红外图像技术具有实现快速、无损、原位、在线分析的特点。通过近红外图像不但能够得到生物组织和化学成分的清晰轮廓和分布信息，而且还可以通过化学计量学方法实现对特定目标成分的定性和定量分析[46]。

Senthilkumar T等[47]使用近红外（NIR）高光谱成像系统对储存的小麦中的白曲霉、青霉属感染和赭曲霉毒素A污染進行检测研究。每两周对真菌感染的样品进行成像，将从图像数据获得的三维超立方体转换成二维数据。将主成分分析应用于二维数据并基于最高因子载荷，1 280，1 300，1 350 nm被识别为有效波长。提取对应于有效波长的6个统计特征和10个直方图特征，应用二次和马氏判别分类器对其进行线性测定。结果显示所有3个分类器从健康内核分离真菌感染的内核分类准确度大于90%。二次判别分类器为成对，双向和六路分类模型提供了比线性和马氏分类器更高的分类精度。赭曲霉毒素A污染的样品除了对应于真菌感染的2个有效波长之外，在1 480 nm具有独特的显著波长，仅在赭曲霉毒素A污染的样品中鉴定在1 480 nm的峰。赭曲霉毒素A污染的样品可以使用NIR高光谱成像系统以100%分类精度检测。 NIR高光谱系统可以区分不同真菌感染阶段和储存小麦中不同水平的赭曲霉毒素A污染。

近红外光谱技术以其速度快、操作简单、效率高、无污染和成本低等特点，已被广泛应用于各个领域，它不但能分析与含氢基团直接相关的有机物，而且在无机物的检测上也有很多成功实例，但是其作用机理有待进一步研究。随着近红外光谱硬件设备成本的不断降低，进一步完善软件的数理统计方法，提高从复杂、重叠和变化的红外光谱中提取有效信息的效率，增加光谱的信噪比，将其应用于中药中赭曲霉毒素A的检测的前景将更加广阔。

5 总结与展望

近些年，随着色谱技术和液相-质谱联用技术的不断升级和推广，有关中药材中真菌毒素，尤其是赭曲霉毒素A污染的报道逐年增加。液相及其质谱联用技术虽然相比过去的薄层色谱等技术在检测时间上缩短了，但是由于其复杂的前处理过程，仪器无法随身携带等缺陷，无法实现实时快速的现场检测。以抗体-抗原免疫反应和适配体为基础的OTA快速检测技术可以填补这个技术空缺。本文综述了可视化试纸条、流式微球技术、电化学传感器、表面增强拉曼光谱技术等可实现仪器小型化、检测快速化、操作简单化的OTA检测方法，同时这些方法充分显示了快速检测在检测速度、灵敏度、检测限上的优势。但是这些快速检测方法或多或少存在着一些缺陷和不足，例如基于抗体的免疫法快速检测，抗体的自身不稳定性和繁琐的制备方法阻碍了该方法的应用普及性和准确性，以及高生物亲和力的纳米材料的制备工艺还未成熟，从而增加了新型快速检测技术的应用成本。所以在未来，高亲和力、稳定性好的抗体体外快速制备技术是解决和推进中药材中OTA快速检测技术障碍的有效途径之一。基于适配体的快速检测方法中功能化磁球等纳米材料的造价较昂贵，随着工业化推进和制备工艺的改善，利用其超低的检测限和超强的去基质干扰能力，有望代替现今抗体制备复杂且费时的免疫检测方法，若将这一模式转移到中药材中真菌毒素（如赭曲霉毒素A）的现场快速检测上，可望实现中药材中真菌毒素实时高通量的快速检测。

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[責任编辑 丁广治]