包素珍魏自太,2李恒楠李小东

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 衢州职业技术学院 浙江 衢州 324000

加味黄芪建中汤对脾气虚证肺癌微环境肿瘤相关巨噬细胞表达的影响*

包素珍1魏自太1,2李恒楠1李小东1

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 衢州职业技术学院 浙江 衢州 324000

脾气虚证 黄芪建中汤 肺癌 微环境 肿瘤相关巨噬细胞 小鼠

中晚期非小细胞肺癌患者中以气虚为主，临床也发现肺癌患者脾气虚最为多见，“脾气虚”环境对肺癌发展有重要影响，本课题在脾气虚模型的基础上，运用加味黄芪建中汤干预脾气虚肺癌转移小鼠，观察中药干预前后脾气虚状态下“脾气虚”变化，研究加味黄芪建中汤干预脾气虚肺癌微环境转移的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验药物：加味黄芪建中汤：黄芪、桂枝各9g，白芍18g，甘草6g，生姜、浙贝母、大枣各10g，饴糖、白花蛇舌草各30g，仙鹤草12g。经水煎、过滤、灭菌，制成含生药1.00g/ml的药液；共144g购自浙江中医药大学中医门诊部。加味黄芪建中汤灌胃，每日0.4ml/20g。大黄浓缩液：大黄300g（药物购自浙江中医药大学中医门诊部），打粉。按1：6，将大黄水浴负压浓缩成300ml大黄液，浓度为1g/ml，大黄液灌胃，每日1ml/20g。

1.2 实验动物：健康C57BL/6小鼠70只，雌性，体重18～22g，小鼠Lewis肺癌瘤株，浙江中医药大学实验动物中心提供。

1.3 试剂：大鼠抗小鼠CD68抗体，北京中杉金桥生物工程公司；DAB显色剂，北京中杉金桥生物工程公司；免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物工程公司。

1.4 造模和分组：脾气虚模型的建立：本实验依据文献资料，采用大黄浓缩煎剂泻下败胃，并结合劳则气耗，损耗脾气的方法造模。70只C57BL/6小鼠，雌性，体重18±2g，在动物实验中心常规适应饲养1周后，随机取20只小鼠在正常环境下饲养，其余50只小鼠采用苦寒泻下法造脾气虚模型（大黄浓缩液灌胃，每只小鼠每次1ml/20g，每日1次），同时每日游泳、间隔1日节食（下午4：00至第2日早晨8：30），连续14天。在脾气虚模型建成后，给正常组10只和脾气虚模型组50只小鼠接种肿瘤。取传代后第13天的C57荷瘤小鼠新鲜无坏死Lewis肿瘤组织，制成肿瘤细胞悬液；肿瘤细胞浓度用生理盐水调整为1× 107个/ml；取上述肿瘤细胞悬液0.2ml，接种于小鼠右腋部皮下。随机将实验小鼠分为5组：①正常组：生理盐水灌胃，每日1次，每次0.4ml；②脾气虚组：生理盐水灌胃，每日1次，每次0.4ml；③肺癌组：生理盐水灌胃，每日1次，每次0.4ml；④脾气虚肺癌组：生理盐水灌胃，每日1次，每次0.4ml；⑤脾气虚肺癌黄芪组：中药加味黄芪建中汤灌胃，每日1次，每次0.4ml。脾气虚证肺癌模型建立后，各组按以上方法给药，连续9天后，进食不禁水12h，第10天脱颈椎处死小鼠。

1.5 肺组织转移结节、肿瘤重量的检测：在处死小鼠后，剪开小鼠胸腔，分离气管，取出肺脏，浸入Bouin氏液固定。固定24h后对肺表面转移结节数观察计数。肺结节抑制率=[1-(给药组平均肺结节/模型组平均肺结节)]×100%。肿瘤抑制率=[1-(给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)]×100%。在处死小鼠后，剥取瘤块，称重，计算抑瘤率。

1.6 不同组别肿瘤组织中CD68检测：标记小鼠肿瘤组织中CD68，CD68为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的标志蛋白之一。本实验以CD68作为TAM标志抗原，检测不同组别肿瘤组织中TAM的浸润程度。三组荷瘤小鼠（脾气虚肺癌组，肺癌组，脾气虚肺癌黄芪组）处死后，小心剥离肿瘤组织标本，经10%甲醛固定，石蜡包埋切片。免疫组织化学操作为EnVision二步法。

1.7 结果判定：使用三张切片重复实验，低倍镜(× 100)下选择CD68阳性最密集区，然后在高倍镜下(× 400)计数5个视野中的CD68(+)细胞、CD68蛋白主要表达在细胞质中，染色呈在黄褐色或黄色，在巨噬细胞的胞浆内表达，胞浆含清晰的颗粒状者为阳性。CD68采用阳性细胞计数法，观察lewis肺癌组织切片中肿瘤相关巨噬细胞最密集的区域，计数5个区域在400倍视野下阳性细胞数，并取其平均值即为该组织切片中的肿瘤相关巨噬细胞浸润的数量。

1.8 统计学方法：采用统计软件包SPSS21.0版统计，计量资料两组间比较用t检验，多组间比较用单因素分析；计量资料数值用均数±标准差表示。

2 结果

2.1 加味黄芪建中汤对Lewis肺癌小鼠瘤重及肺内转移的影响：见表1。

表1 各组小鼠瘤体重量及肺内转移情况比较（±s）

表1 各组小鼠瘤体重量及肺内转移情况比较（±s）

注：与肺癌组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与脾气虚肺癌组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

44.90%组别肺癌组脾气虚肺癌组脾气虚肺癌黄芪组瘤重（g）2.27±0.91 3.02±0.48#1.69±0.37**瘤抑制率抑制率25.62%肺转移灶数3.63±0.74 4.88±0.83#2.00±0.53##*

2.2 各组Lewis小鼠肿瘤组织中CD68蛋白免疫组化的结果：见表2。lewis肺癌组织切片中肿瘤相关巨噬细胞的CD68蛋白主要表达在细胞质中，染色呈黄褐色或黄色，阳性细胞多弥散在癌巢周围，脾虚肺癌组相关巨噬细胞浸润的数量最多，肺癌组次之，脾气虚肺癌黄芪组最少。见图1。

表2 不同组别小鼠CD68的表达（±s）

表2 不同组别小鼠CD68的表达（±s）

注：与脾气虚肺癌黄芪组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与肺癌组比较，##P＜0.01。

CD68阳性细胞数220.20±52.26**##123.00±27.27*100.00±15.87组别脾气虚肺癌组肺癌组脾气虚肺癌黄芪组

图1 各组lewis肺癌组织切片中肿瘤相关巨噬细胞的CD68蛋白表达（×40）

3 讨论

中医学认为，肿瘤的发生首先是患者的正气不足，“邪之所凑，其气必虚”，而“正气存内，邪不可干”，所以培补正气为治疗肿瘤的重要原则之一。同时，恶性肿瘤虽然局限于某一部位，但其发生还是转移，均是机体内外多种因素共同作用的结果，所以说局部病灶与全身的关系是密不可分的，故防治肿瘤转移时必须树立整体观念。依据“脾气虚”肺癌的病机，选择加味黄芪建中汤擅建中气。方中，饴糖为君，甘以润土，土润则万物生，白芍酸寒，和营敛阴，津液得通，黄芪甘能补血补气，则脾胃气血大壮；桂枝行气活血，三药合用，取辛甘化阳之义；白芍、甘草酸甘化阴，能缓挛急而止痛；生姜、大枣辛甘相合，健脾胃而通营卫；浙贝母、白花蛇舌草和仙鹤草解毒散结。全方温中健脾，清热解毒、消痛散结，用治阴阳两虚而“脾气虚”肺癌。亦有研究发现[1]采用黄芪建中汤可明显改善小鼠的整体情况，有一定的抑瘤作用，可能与上调caspase3-mRNA的表达的转录有关。

本次实验结果显示：肺癌组转移瘤结节数量少于脾气虚肺癌组，在脾气虚肺癌组小鼠肺组织表面转移瘤结节数量最多，结节较大。在加味黄芪建中汤干预的黄芪组则转移瘤结节数量最少，结节较小。同时，脾气虚肺癌组瘤重最大。脾气虚肺癌黄芪组瘤重最小。表明“脾气虚”促进了肿瘤的增殖生长及在肺内的转移，而加味黄芪建中汤则能抑制肿瘤的生长，且也可抑制肿瘤的转移。

在肿瘤不同部分的巨噬细胞通过释放生长因子，细胞因子，趋化因子，酶等物质而扮演不同的角色，入侵领域的巨噬细胞促进肿瘤细胞的运动，间质及血管周围地区的巨噬细胞促进转移，无血管和缺氧坏死区肿瘤相关巨噬细胞刺激血管生成[2]。CD68为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的标志蛋白。本实验以CD68作为TAM标志抗原，检测不同组别肿瘤组织中TAM的浸润程度。从实验结果分析，脾虚肺癌组相关巨噬细胞浸润的数量最多，肿瘤组相关巨噬细胞浸润的数量次之，肺癌黄芪组肿瘤相关巨噬细胞浸润的数量最少。脾气虚肺癌组织TAM（CD68）浸润密度最高，肺癌组TAM（CD68）浸润密度次之，脾气虚肺癌黄芪组TAM浸润密度最低。说明“脾气虚”促进了肿瘤微环境中相关巨噬细胞的浸润，可能多方面促进了肿瘤的生长增殖，转移，而加味黄芪建中汤可能通过抑制肿瘤TAM的浸润从而抑制肿瘤的生长和转移。

既然肿瘤微环境在肿瘤的增殖，迁移，黏附，转移中发挥着重要的作用，加味黄芪建中汤一方面能够培补正气，改善“脾气虚”的证候，另一方面，其有效成分具有广泛的抗癌作用，多靶点，多方面发挥抑制肿瘤的作用，从病证结合角度阐明脾气虚对肺癌微环境变化的影响及与肺癌转移的关系，揭示肺癌微环境脾气虚的病机，并通过健脾益气中药加味黄芪建中汤对脾气虚肺癌微环境的作用机制研究，说明健脾益气中药干预脾气虚肺癌的客观依据，为中医理论研究添砖加瓦。

[1]包素珍,郑小伟,孙在典,等.黄芪建中汤对脾气虚证肺癌小鼠caspase-3表达的影响[J].浙江中医杂志,2013,48(3)：116-118.

[2]Lewis CE,Pollard JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res, 2006,66(2)：605-612.

2016-12-14

浙江省自然科学基金资助项目肺癌微环境脾气虚病机及黄芪建中汤干预机制研究，编号：LY13H270010