李石清宋洁，2张春椿张水利张婷#许健

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 复旦大学 上海 200433

实验研究

参附注射液对慢性心衰大鼠心功能及心肌细胞内Ca2+浓度的影响*

李石清1宋洁1，2张春椿1张水利1张婷1#许健1

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 复旦大学 上海 200433

参附注射液 慢性心衰 钙离子 心功能 实验研究

本实验主要研究参附注射液对慢性心衰大鼠心功能及心肌细胞内钙离子浓度的影响，探讨参附注射液改善心衰的机制，以期为临床应用提供更有力的实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料：雄性SD大鼠30只，体重200±20g[宁夏医科大学实验动物中心，动物批号：SVXK(宁)2011-0001]；参附注射液（雅安三九药业有限公司，批准文号：国药准字Z20043117，批号：140106050）；0.9%氯化钠注射液（第二军医大学附属长海医院）；Ca2+荧光试剂Fluo-3/ AM、咖啡因（Sigma，美国）；II型胶原酶（Worthington，美国）；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器：ALC-V8动物呼吸机（上海奥尔科特生物科技有限公司），UC-6超薄切片机（德国Leica公司），1/10000精密电子分析天平、Delta 320-S型PH计（Mettler Toledo公司），JB-90-1型磁力搅拌器（上海天平仪器厂），H-7650透射电子显微镜（日本HITACHI公司），Acuson sequoia 512高频超声诊断仪（德国西门子公司），LeicaTCSSP2激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica公司），HL-2型恒流泵（上海沪西分析仪器厂）。

2 实验方法

2.1 慢性心衰大鼠模型制备及分组：采用冠状动脉左前降支结扎法建立大鼠慢性心衰模型[1]。成年雄性SD大鼠采用气体麻醉机麻醉，沿胸骨左缘第3、4肋间开胸，暴露心脏打开心包，在左心耳和肺动脉圆锥之间用5/0无损伤缝合针结扎左冠脉前降支，进针深度控制在0.1cm，注意避免心肌撕裂。肉眼可见左心室前壁颜色变白，标准肢体Ⅱ导联心电图ST段抬高，即为结扎成功，立即将心脏送回胸腔，排尽胸腔空气，再对胸腔逐层缝合，闭合胸腔，自然清醒后饲养。将造模成功大鼠随机分为心力衰竭组（CHF）和参附注射液（SFI）处理组，每组10只。另设假手术组（Sham组），10只，除只穿线不结扎冠脉外，其余步骤一致。参附注射液处理组用6ml/kg参附注射液腹腔注射给药，假手术组和心力衰竭组给予同等剂量的生理盐水，每天1次，连续4周。

2.2 超声心动指标测定：采用Acuson sequoia 512高频超声诊断仪，探头频率8.5MHZ，扫描速度100mm/s。气体麻醉机麻醉大鼠，连续测3个心动周期的左室前壁舒张末期厚度（LVAWd）、左室前壁收缩末期厚度（LVAWs）、左室后壁舒张末期厚度（LVPWd）、左室后壁收缩末期厚度（LVPWs）、左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）、左室短轴缩短率（LVFS）、左室射血分数（LVEF），取其平均值。

2.3 超微结构观察：按照常规透射电镜样品制备技术制样[2]，取心脏部分心肌组织，经前固定、漂洗、后固定、脱水、浸透、包埋、修片、切片及染色后，置于透射电子显微镜下观察，拍照记录其超微结构。

2.4 单个心室肌细胞的分离：采用标准酶解分离技术得到心力衰竭组和假手术组单个心室肌细胞[3]，雄性SD大鼠经10%水合氯醛麻醉后，迅速开胸取出心脏挂于Langendorff逆行性灌流系统，游离主动脉行主动脉插管，分别用无钙台式液和含72mmol/L Ca2+、0.6mg/mlⅡ型胶原酶和2mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)的台式液逆向灌流，消化终点以心脏变软等现象为标准；剪下心室组织，在37℃Kraft-Bruhe（KB）液中将其剪碎，并用广口吸管吹打1min，200目尼龙网过滤后，室温沉淀10min，弃上清液，KB液重悬，室温静置1～2h后备用。

2.5 荧光染色及分组给药：将静置后的心肌单细胞先与钙荧光指示剂Fluo-3/AM(10μmol/L)室温避光孵育30min，然后用KB液漂洗3次，每次10min。室温放置30min后置于含细胞外液的细胞池中，胞外灌流10min。参附注射液（SFI）随胞外灌流液作用于心肌细胞，分别按0、1.25%SFI、2.5%SFI、5%SFI和10%SFI与细胞外液混合，每组重复6次。

2.6 大鼠心肌细胞钙释放峰值实验：采用Leica TCSSP2激光扫描共聚焦显微镜观察，激发光采用5%的低能量，激发波长488nm，发射波长505nm。扫描频率为400Hz，每条线包含1024个像素，采样速率为2ms/线。物镜为40倍油镜，数值孔径值（NA）为1.25。选择合适的心肌细胞（横纹清晰，杆状，表面干净平整，无自发收缩等），扫描线与细胞纵轴平行且位于垂直切面中间，扫描5秒后，给予咖啡因刺激测得肌浆网（SR）内可释放的钙容量。图像处理采用自编的激光扫描共聚焦显微镜图像处理软件。钙瞬变（ACT）的强弱以标准荧光强度的净变化即#F/F0=(F-F0)/F0表示，其中F表示某一时间点的荧光强度，F0表示本底荧光强度[4]。

2.7 统计学方法：采用SPSS21.0统计软件包进行分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 心衰模型相关心功能指标的测定：雄性成年SD大鼠行冠状动脉左前降支结扎术后，肉眼可见左心室前壁颜色变白，标准肢体Ⅱ导联心电图显示术后心电图ST段抬高，造模成功。4周后，高频超声诊断仪测定心功能相关指标。见表1。

表1 大鼠心功能指标的测定（±s，n=10）

注：与Sham组比较，**P＜0.01；与CHF组比较，##P＜0.01。

组别Sham组CHF组SFI组LVAWd(mm) 1.98±0.24 1.48±0.24**1.89±0.19##LVAWs(mm) 3.41±0.39 2.00±0.29**2.72±0.37##LVPWd(mm) 2.01±0.29 1.70±0.19**1.95±0.21##LVPWs(mm) 3.56±0.35 2.25±0.39**2.81±0.20##LVIDd(mm) 7.34±0.40 9.20±0.65**4.89±0.72##LVIDs(mm) 3.80±0.25 6.70±0.78**4.89±0.72##LVFS(%) 84.13±0.94 57.75±7.11**72.93±1.07##LVEF(%) 48.11±1.07 27.12±4.45**37.48±0.86##

3.2 参附注射液对慢性心力衰竭大鼠心肌超微结构的影响：各组大鼠心肌组织超微结构观察结果显示，Sham组大鼠心肌肌纤维整齐排列，肌丝之间的线粒体结构完整，内部嵴清晰可见，未见肿胀或破裂（图1a）。CHF组大鼠心肌出现大面积肌丝溶解、断裂、松散，大部分肌丝排列疏松并且有出现错位，线粒体电子密度增大，一部分线粒体的嵴结构模糊不清，且出现溶解现象（图1b）。SFI组大鼠心肌肌丝结构排列整齐，可见轻度溶解，线粒体结构完整，大部分嵴结构完整可见（图1c）。

3.3 单个心室肌细胞的分离：本实验中，刚分离下的心肌细胞存活率达80%左右，在显微镜下观察，细胞呈长杆状，Z线清晰，横纹分明。见图2。

3.4 参附注射液对心肌细胞内钙离子浓度的影响：静息状态下肌浆网（SR）内钙容量可通过咖啡因诱发的钙瞬变（CCT）来衡量[3]。心肌细胞经Fluo-3/AM孵育处理，以喷射咖啡因前作为本底荧光对照，采用激光扫描共聚焦显微镜线扫描模式记录单个心肌细胞SR内的钙容量。重复6次取平均值，得到表2。结果显示，CHF组较Sham组荧光强度及荧光强度变化的平均值（ΔF/F0）均明显降低（P＜0.01）（图3b）。SFI组各浓度处理后的CHF大鼠与不处理（0 SFI组）相比，大鼠心肌细胞的荧光强度及平均值（ΔF/F0）均显著增加（P＜0.01，P＜0.05），且呈浓度依赖性（图3b）；但5%和10%SFI处理组间未见显著差异（图3b）。Sham组大鼠心肌细胞给予不同浓度的SFI（1.25%，2.5%，5%，10%）处理后，荧光强度随浓度增加而增大（P＜0.05），5%与10%浓度SFI处理组间未见显著差异（图3a）。图3c显示，不同浓度SFI处理CHF组后，荧光强度变化的整体趋势均低于SFI相应浓度处理后的假手术组。这些结果表明，参附注射液可增大心肌细胞内肌浆网内的钙容量。

图1 参附注射液对慢性心力衰竭大鼠心肌超微结构的影响（bar=500nm）

图2 分离得到的单个心室肌细胞（bar=20μm）

表2 各组大鼠心肌细胞钙释放含量的测定（±s，n=6）

表2 各组大鼠心肌细胞钙释放含量的测定（±s，n=6）

注：与Sham组0 SFI处理后比较，**P＜0.01；与CHF组0 SFI处理后比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

分组Sham组CHF组正常细胞外液+参附注射液处理10%SFI 33.40±2.73**7.73±0.86##0 SFI 12.60±2.31 2.28±0.59 1.25%SFI 18.55±1.86**4.89±0.18#2.5%SFI 24.18±1.53**5.23±0.23#5%SFI 31.10±1.27**7.02±0.57##

图3 参附注射液对心肌细胞内钙离子浓度的影响

4 讨论

心力衰竭（简称心衰）是一种复杂的临床综合征，主要是由于神经-体液系统、内分泌系统、循环系统改变等多因素导致的心脏结构或功能异常，导致心脏射血或舒张功能障碍，从而产生以活动耐量受限、肺瘀血以及外周水肿为主要临床表现的一系列病理生理改变[5-6]。参附注射液由红参和附子两味药构成，源自《济生方》中的参附汤。中医学认为人参益气固脱、大补元气，附子回阳救逆、补火助阳。静脉滴注参附注射液，有益气活血、回阳救脱、强心生脉之效[7]。现代药理研究表明，人参与附子均具有强心和抗心肌缺血的药理作用。

本实验采用气体麻醉对大鼠行左前降支结扎术建立大鼠心力衰竭模型，无需开胸、插管，手术快、创口小、动物出血少，避免了气管插管对呼吸道的损伤，减少手术创伤，提高了模型的存活率，本模型是低心输出量型心衰模型[1]，经历了从心肌梗死、代偿性心肌肥厚到心衰等过程，较好地模拟了充血性心力衰竭的生理病理演变过程。

实验研究发现，心力衰竭大鼠心肌超微结构较假手术组发生明显改变，肌丝排列错位紊乱或断裂溶解，线粒体聚集或无规律零散分布，线粒体发生肿胀、融合、嵴消失或变短，在线粒体周边可见较多糖原聚集，提示存在心肌细胞代谢及能量利用障碍。而参附注射液（6ml/kg）按腹腔给药，每日1次，持续4周，透射电镜结果显示其可明显改善心力衰竭大鼠的上述症状，提示心肌细胞能量代谢功能改善，可为心肌细胞收缩提供ATP[2，4]，这很可能是其整体心脏功能改善的结构基础。另一方面，参附注射液处理后的心衰大鼠心功能指标与心衰组相比有明显改善，LVPWd/LVPWs，LVAWd/LVAWs，LVIDd/LVIDs均明显减小，而LVEF、LVFS则明显增大，这一结果显示了参附注射液可以有效减轻代偿性心肌肥大，从而恢复和改善慢性心衰大鼠的心脏舒张收缩功能。大鼠心肌细胞钙释放峰值实验显示，心力衰竭组大鼠心肌细胞内咖啡因触发荧光强度的峰值明显低于假手术组，说明心力衰竭组大鼠肌浆网钙储量明显降低，导致收缩期钙释放减小，影响心肌的收缩力。经一定浓度（1.25%、2.5%、5%、10%）的参附注射液处理后，发现咖啡因触发的钙释放荧光强度增强，且呈浓度依赖性，提示参附注射液可能改善心衰心肌细胞的肌浆网钙储量，增加收缩期钙瞬变的幅度，从而增强心肌收缩力，有助于心衰大鼠心功能的恢复。

综上所述，本实验从整体动物、细胞以及超微结构等水平都证实了参附注射液可以改善心力衰竭大鼠的心功能，其机制可能是增加肌浆网内钙含量，减少心衰时心肌细胞的超微结构损伤，从而达到改善心衰、保护心脏的作用。本研究结果为参附注射液用于临床治疗心力衰竭提供了新的理论依据。

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2017-03-24

国家自然科学基金资助项目基于心肌保护蛋白及离子通道的参附药对“扶阳固脱”改善心衰的配伍机制研究，编号：81373991

#通讯作者：张婷，E-mail：elaine.zt@gmail.com