张娅婷+秦广雍+孔令军+张书胜

摘 要 以茶树鲜叶为原料，利用亚临界丁烷流体分离鲜叶表面残留的阿维菌素。在料溶比为1∶10（m/V）的条件下，利用响应面法（RSM）的BoxBenhnken Design（BBD）设计实验，考察不同温度、时间、分离次数等条件对多酚氧化酶活性的影响，同时分析亚临界丁烷处理对茶树鲜叶生理特性的影响。结果表明，亚临界丁烷流体在保持茶叶物理结构和多酚氧化酶活性基本不变的情况下，可有效分离茶叶中的阿维菌素；通过Design Expert软件分析，得出分离阿维菌素的最优工艺参数为温度45℃，时间30 min，分离次数1次，料液比为1∶10（m/V），分离效率大于91%，多酚氧化酶相对活性为25.73%。通过扫描电镜观察，茶树鲜叶结构在丁烷处理前后无明显变化。本研究结果表明，亚临界丁烷流体可有效分离茶叶中的农药残留，为亚临界流体在去除天然植物农残的应用中提供了实验依据和技术支持。

关键词 亚临界丁烷； 阿维菌素； 分离； 茶叶； 多酚氧化酶

1 引 言

茶叶中含有茶多酚、咖啡碱、氨基酸等多种营养成分和药效成分，具有降脂降压、抗衰老等保健功效。近年来，我国茶叶产量一直居世界首位，带动了全球茶叶产量持续增长[1]。然而由于不科学使用以及滥用农药，茶叶中农药残留问题依然比较普遍，发达国家对茶叶农残设置了限量标准，引起了茶叶生产国的高度关注[2，3]。

茶叶中农残的检测技术有很多文献报道[4，5]，但农残分离的研究相对较少。目前，主要采用超临界流体萃取（SFE）技术[6]、加速溶剂萃取（ASE）技术[7，8]等分离茶叶样品中农药残留。这些方法对样品都有不同程度的破坏，无法在保持样品原形的情况下分离农残，而且所需工作压力较大（7～50 MPa），处理样品量少，不适于大规模产业化生产[9，10]。

亚临界萃取技术已广泛应用分离在特种油脂、香精香料等领域[11～13]，具有萃取压力低、温度低、效率高、无有害溶剂残留、绿色环保等优点[14]，可用于工业化生产。联合国粮农组织指出丁烷可广泛用于食品加工[15]，而美国、日本及欧洲等国没有对丁烷残留的限量要求[16]。

阿维菌素（Avermectin）是由链霉菌生产的具有高效杀虫杀螨效果的抗生素[17]，在我国被广泛用于茶叶等农作物的虫害防治。目前，使用亚临界流体技术分离农残的研究报道还很少[18，19]。本研究用亚临界流体丁烷分离茶树鲜叶中残留的阿维菌素；利用响应面法（Response surface methodology，RSM）的BoxBenhnken Design（BBD）原理，使用DesignExpert. V8.0.6.1软件进行分析，优化筛选亚临界流体丁烷分离茶树鲜叶中阿维菌素的最佳工艺；通过对茶叶品质指标多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）的检测和分析，探讨此技术的可行性。本研究旨在不破坏茶叶外形的前提下， 实现茶叶表面的农药残留的高效分离，为天然植物表面农残的去除提供理论和技术支持。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CBE5L亚临界流体装置（河南亚临界公司）；API4000四极杆串联质谱仪（美国ABI公司）；1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DJ04B中药粉碎机（中国上海淀久公司）；FA1104分析天平（上海舜宇恒平公司）；VX200振荡器（美国Labnet公司；3k15高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；JSM6700F扫描电子显微镜（日本电子产业株式会社）；DU800核酸蛋白分析仪（美国Beckman公司）。

多酚氧化酶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、偏磷酸、柠檬酸、NaH2PO4（分析纯）； L脯氨酸（层析纯）、邻苯二酚（化学纯）均购于上海阿拉丁公司。乙腈、甲醇、丙酮、正己烷（色谱纯，美国Baker公司）；N丙基乙二胺吸附剂（PSA，美国Supelco公司）；牛血清蛋白（BSA，美国Roche公司）；丁烷（纯度≥95%，河南亚临界公司）。实验用水为超纯水（18 MΩ.cm）。阿维菌素标准品（Avermectin）、氯唑磷标准品（Isazofos）（纯度≥95%，德国Dr. Ehrenstorfer公司），用乙腈配制成标准工作液。

2.2 实验方法

2.2.1 样品制备 选择信阳地区某茶园主栽的福鼎大白茶为原料。喷洒正常浓度两倍的阿维菌素（0.5%乳油），3天后采摘茶树枝条顶端的第1～3片叶（由上至下计），低温保存、运输。取茶树鲜叶100 g，在保证茶叶外形的条件下装入200目过滤袋，置于密闭萃取罐中；定量注入丁烷液体，控制亚临界萃取装置的温度和压力；样品处理完毕后，30℃保存，待检；每个样品重复处理3次。

2.2.2 BoxBehnken的响应面设计 在单因素预实验中，设置温度（15、25、35和45℃）、时间（10、20、30和40 min）、分离次数（1、2、3次）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15， m/V）4個变量因子，以样品处理前后阿维菌素的减少量为分离量，计算农残的分离效率。由于茶树鲜叶要经过发酵、杀青等不同制茶工艺处理[21]，为了避免高温导致多酚氧化酶失活[22]，设置温度上限为45℃。

预实验结果表明，料液比对实验结果无显著影响，可能是因为所用的丁烷相对于茶叶表面的农残是过量的。以BoxBehnken中心组合设计为原理，以温度、时间、分离次数3个因子为自变量（分别以A，B，C表示），以阿维菌素分离量为响应值（以y表示），设计了3因子3水平共17个实验点的响应面分析实验，实验所用料液比为1∶10，每个实验点样品重复处理3次。响应面设计的参数详见表1。

2.2.3 农残检测方法 标准溶液的配制：准确称取阿维菌素标准品，用乙腈配制成10 μg/mL的标准储备液。称取氯唑磷标准物质，用乙腈稀溶解并配制成20 μg/mL内标使用液[22]。