史冬赵建玉闫振宇李玺

(南阳市第三人民医院神经内科，河南 南阳 473000)

NF-κB调节TNF-α表达减轻大鼠缺血性脑血管病脑组织损伤

史 冬 赵建玉闫振宇1李 玺

(南阳市第三人民医院神经内科，河南 南阳 473000)

目的 研究缺血性脑血管病(ICVD)核因子 (NF)-κB对肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的影响及其对大鼠脑组织损伤的作用。方法 将48只Wistar大鼠随机分成正常组(12只)、模型组(12只)、假手术组(12只)和吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)+模型组，每组12只。采用线栓法制成大鼠局部缺血再灌注模型，用Ludmila Belayev 12分评分法评估大鼠神经功能，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)染色法观察脑梗死体积，免疫组化法检测脑组织NF-κB表达，酶联免疫吸附法(ELISA)测脑组织TNF-α含量。结果 模型组大鼠Ludmila Belayev 12得分明显高于正常组与假手术组(P<0.05)，PDTC+模型组得分显著低于模型组(P<0.01)；模型组大鼠的脑梗死体积显著多于正常组和假手术组(P<0.01)，与模型组比较，PDTC+模型组大鼠脑梗死体积显著减少(P<0.05)；模型组大鼠脑组织NF-κB阳性细胞表达率显著高于正常组和假手术组(P<0.05)，DPTC+模型组NF-κB表达明显低于模型组 (P<0.05)；模型组大鼠TNF-α的含量显著高于正常组和假手术组(P<0.01)，PDTC+模型组TNF-α含量明显低于模型组(P<0.05)。结论 PDTC抑制NF-κB活性可以减少TNF-α含量，降低TNF-α的表达，所以可通过NF-κB调节TNF-α表达对缺血再灌注脑损伤起到保护作用，可能与其抑制炎症反应作用有关。

缺血性脑血管病；脑损伤；核因子-κB；肿瘤坏死因子α

脑血管疾病(CVD)是因为各种脑血管病变引起的脑部病变，多发生于中老年人，特别是伴有高血压、冠心病、脑卒中病史的人群，以缺血性脑血管病(ICVD)为主，容易致残、致死，威胁患者的生命〔1〕。大脑发生缺血时核因子(NF)-κB可被活化，活化的NF-κB可调控如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β等物质表达增加而引起炎症级联反应，导致脑组织损伤。本文旨在探讨NF-κB活性对TNF-α表达的影响及其对ICVD脑组织损伤的保护作用。

1 材料及方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级Wistar大鼠48只，雄性，体重(250±10)g，购自广东省医学实验动物中心(许可证号：0045071)，饲养在安静清洁实验动物房内，温度(24±2)℃，自然光照12 h，6只/笼，自由摄水及进食。

1.2 实验药品、试剂和仪器 TNF-α酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)，一抗二抗免疫组化试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)，氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(TTC) (美国SIGMA，批号T8877)，WD-2102A自动酶标仪(北京六一仪器厂)，MIAS-2000图像分析系统(美国Bio-Rad公司)，BX5/TF显微镜(日本Olympus)，大鼠手术器械包括手术刀、无菌镊、止血夹、眼科剪、缝合针、缝合线等。

1.3 动物分组及处理 48只大鼠在笼中饲养5 d以适应环境，随机分成正常组、模型组、假手术组、吡咯烷二硫基甲酸酯(PDTC)+模型组，每组12只。正常组常规喂养，模型组术前禁食12 h，按改良后线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型，再参照Ludmila Belayev 12分评分法做行为学评分以剔除不符合条件的动物，假手术组除不插入栓线外，其余操作均与模型组相同，PDTC+模型组在造模前15 min给予腹腔注射PDTC 15 mg/kg，150 mg/ml。

1.4 线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型〔2〕10%水合氯醛30 mg/kg经腹腔麻醉，将大鼠固定于手术台，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉并分离出颈内动脉和颈外动脉，动脉夹阻断颈总动脉，于颈外动脉残端剪一开口插入栓线，轻缓推动尼龙线尾端，于颈内动脉和颈外动脉分叉部沿颈内动脉入颅，推入大约18.0 mm至大脑中动脉，遇到阻力即止。取出动脉夹，结扎颈总动脉分叉处并缝合皮肤。90 min后，再次麻醉大鼠，向外轻拉尼龙线，恢复大脑中动脉血供，完成再灌注。

1.5 Ludmila Belayev 12分评分法〔3〕(1)提尾悬空试验，即姿势反射测验：0分表示无明显神经功能缺失，1分表示梗死对侧肢体屈曲，2分表示侧推试验阳性。(2)肢体放置试验：①视觉亚实验，即前言刺激实验：操作者将大鼠握于手中，使其前爪悬空，自桌面上方10厘米处沿斜线缓慢靠近桌面，正常大鼠的反应为前爪抓向桌面，损伤的大鼠则出现肢体反应迟钝。0分表示大鼠肢体放置反应正常，1分表示反应延迟但<2 s，2分表示反应延迟并>2 s。侧方刺激实验：操作者让大鼠位于桌子侧方，检测方法及评分标准与前方刺激相同。②触觉亚实验，遮住大鼠双眼，使其前爪悬空，用大鼠前爪背侧轻触桌面，刺激深度仅限皮肤与毛发，大鼠反应及评分与视觉亚实验相同，触觉刺激同样包括前方和侧方刺激。③本体觉亚实验：该实验操作及评分与触觉亚实验相同，只是本体觉亚实验给予大鼠前爪较大压力，刺激深达肌肉和关节。该亚实验只有前方刺激，动物前肢放置实验得分为0～10分。与视觉亚实验结合后两部分实验得分范围为0～12分，大鼠功能损伤越重得分越高。

1.6 大鼠脑梗死体积检测〔4〕成功造模24 h后用1%戊巴比妥钠麻醉状态下迅速断头取脑，摘除小脑、低位脑干及嗅球，大脑组织于冰箱-20℃保存20 min后取出，连续冠状切片6片，厚5 mm，以2%TTC磷酸缓冲液37℃，恒温避光孵育20 min，期间脑片翻动频率为1次/5 min。TTC染色后，正常大鼠脑组织呈红色，梗死区呈白色，将脑片固定于4%多聚甲醛30 min，拍照后用Image-pro plus6.0图像分析软件分析，按公式计算脑梗死体积，结果以脑梗死体积百分比表示〔5〕，脑梗死体积百分比=脑梗死体积/患侧总体积×100%。

1.7 免疫组化法检测大鼠脑组织NF-κB表达〔6〕取脑组织固定于4%多聚甲醛60 min，脱水，蜡块包埋，切片，置于58℃烤箱1 h抗原热修复，脱蜡、水化，3%双氧水孵育10 min，洗片3次，试剂A于室温下孵育10～15 min，倒除工作液，一抗用PBS 1∶80稀释后滴于切片，湿盒中37℃孵育2～3 h，再置于室温30 min，PBS浸洗3次，每次3 min，滴加试剂B和试剂C，室温孵育15 min，PBS浸洗3次，每次3 min，DAB显色，冲洗，苏木素复染，冲洗，脱水，风干，树胶封片，于BX5/TF显微镜下观察并拍照(10×40倍)，每个切片取5个视野，以MIAS-2000图像分析系统定量分析，计算阳性细胞率(%)=阳性细胞/总细胞数×100%。

1.8 ELISA法测脑组织TNF-α含量 取脑方法同前，参照ELISA试剂盒说明书严格操作，加入相应体积裂解液并匀浆，离心30 min后取上清检测，计算平均OD值。

1.9 统计学处理方法 采用SPSS12.0软件行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1 大鼠缺血再灌注后Ludmila Belayev 12评分结果、脑梗死体积百分比 线栓法制作大鼠缺血再灌注模型后，模型组大鼠Ludmila Belayev 12得分〔(6.61±0.53)分〕明显高于正常组与假手术组(均为0分)(P<0.05)，PDTC+模型组得分〔(2.20±0.61)分〕显著低于模型组(P<0.01)；模型组大鼠的脑梗死体积〔(69.12±4.18)%〕显著多于正常组和假手术组(均为0)(P<0.01)，与模型组比较，PDTC+模型组大鼠脑梗死体积〔(27.25±1.43)%〕显著减少(P<0.05)。

2.2 大鼠脑组织NF-κB表达和TNF-α含量 激活的NF-κB从胞质进入胞核内呈棕黄色，模型组大鼠脑组织NF-κB阳性细胞表达率〔(56.27±1.08)%〕显著高于正常组〔(6.01±0.51)%〕和假手术组〔(10.13±0.32)%〕(P<0.05)，PDTC+模型组NF-ΚB表达〔(28.86±0.19)%〕明显低于模型组(P<0.05)。ELISA法显示：模型组大鼠TNF-α的含量(58.61±1.59)显著高于正常组(31.06±1.42)和假手术组(24.95±1.34)(P<0.01)，PDTC+模型组TNF-α含量(35.20±1.63)明显低于模型组(P<0.05)。见图1。

图1 免疫组化法检测大鼠脑组织NF-κB表达(×400)

3 讨 论

ICVD指脑动脉狭窄或闭塞引起相应部位脑组织缺血缺氧甚至坏死，脑缺血将诱发膜脂质降解、氧化应激、离子超载、炎症反应、DNA损伤等病理生理改变并发生神经细胞凋亡〔7〕，造成神经损伤〔8〕。本研究选用对生理指标影响不大的线栓法建立缺血性脑血管病大鼠模型，结果显示大脑中动脉闭塞导致大鼠脑组织缺血、功能受损，表现出预期的行为学症状和病理学改变，提示模型建立成功。

现有资料表明，脑细胞代谢障碍、炎症反应、自由基损伤等是ICVD的重要损伤机制〔9〕，炎症细胞和炎症因子在脑缺血损伤过程中地位和作用越来越受到重视。NF-κB对神经细胞具有一定的保护作用，可能通过以下方式〔10〕：①促进神经元凋亡抑制蛋白(IAP)表达，稳定细胞内钙稳态，促进钙结合蛋白转录，保护神经元；②抑制谷氨酸受体亚单位表达；③诱导超氧化物歧化酶转录；④参与TNF-α抗凋亡作用，TNF-α通过NF-κB活化从而调控Bcl-2和Bcl-x的表达实现抗凋亡。但细胞受到氧化应激、细胞因子、内毒素等刺激时，会诱导NF-κB活化，进入细胞核内可激活多种促炎基因的转录，上调TNF-α、白细胞介素(IL)-8、黏附分子(ICAM)-1等多种炎症因子的表达，作为脑缺血后炎症级联反应的启动因素调控着炎症反应的发生与进展〔11，12〕；同时这些炎症因子又会激活NF-κB，后者将使TNF-α、IL-1β等大量表达，启动炎症级联反应，甚至诱导细胞凋亡或死亡，形成恶性循环〔13〕。可能因为大脑缺血导致大量炎症因子、活性氧流入，激活NF-κB，诱导TNF-α表达等从而参与大脑缺血损伤，又因为TNF-α的增多而导致NF-κB表达进一步增加，放大炎症反应，如此循环加重脑组织损伤。黄小平等〔14〕证实黄芪和三七可以抑制小鼠缺血再灌注模型脑组织NF-κB信号通路的激活，减少TNF-α、IL-1β等炎症因子表达，减轻脑组织的继发性炎症反应，从而保护脑组织；邓冰湘等〔15〕亦报道一些药物可通过抑制NF-κB，下调TNF-α等转录水平，从而抑制炎症反应，最终发挥抗炎和保护脑细胞作用；朱晓瓞等〔16〕认为还可以通过NF-κB通路来调节神经细胞凋亡。抗氧化剂PDTC是NF-κB的活化抑制剂，通过抑制NF-κB的活性有效抑制脑组织TNF-α的表达，其阻断炎症恶性循环，干预脑缺血的病理过程，从而减轻脑缺血再灌注损伤〔17〕，实现保护脑组织。

1 徐 畅，王晓梅，朱 刚，等.缺血性脑血管病患者血清MMP-8和IL-6水平与颈动脉粥样硬化的关系〔J〕.现代生物医学进展，2015；15(28)：5459-61，5471.

2 孟祥亚，王鹏琴.针灸对大鼠脑缺血再灌注损伤NF-κB信号通路影响〔J〕.辽宁中医药大学学报，2014；16(5)：9-11.

3 王鹏成，任长虹，曾现伟，等.4种神经功能评分法在大鼠局灶性脑缺血模型中的比较研究〔J〕.潍坊医学院学报，2014；36(2)：147-51.

4 张朝弘，刘丹彥.雷公藤红素后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织NF-κB及TNF-α、IL-1β的影响〔J〕.重庆医科大学学报，2015；40(1)：37-41.

5 刘 楠，于雪凡，李 岩，等.缺血后处理对大鼠脑缺血/再灌注损伤内质网应激通路相关分子的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2014；31(3)：203-6.

6 冯银玲，马翔凌，陈 金，等.GCs对血管痴呆大鼠认知功能及海马脑区NF-κB表达影响的实验研究〔J〕.中风与神经疾病杂志，2016；30(11)：997-1000.

7 Kim AS，Easton JD，Johnston SC.Risk of stroke after transient ischemic attack or minor stroke〔J〕.N Engl J Med，2016；375(4)：386-7.

8 Rolova T，Dhungana H，Korhonen P，etal.Deletion of nuclear factor kappa Bp50 subunit decreases inflammatory response and mildly protects neurons from transient forebrain ischemia-induced damage〔J〕.Aging Dis，2015；7(4)：450-65.

9 张小芸，尹昌浩，郭艳芹.炎症反应与脑缺血-再灌注损伤的研究进展〔J〕.牡丹江医学院学报，2013；35(6)：81-4.

10 邢戈贝莉，李自如，郭力军.核转录因子NF-κB与缺血性脑血管病的研究〔J〕.内蒙古医学杂志，2014；46(3)：298-301.

11 Iqbal S，Ali M，Iqbal F.Effect of creatine monohydrate supplementation on relative serum level of IL-6 and IL-18 following neonatal hypoxia ischemia in male albino mouse〔J〕.Pak J Pharm Sci，2015；28(6)：2141-5.

12 Zhou X，Gu J，Gu Y，etal.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improve learning and memory function in hypoxic-ischemic brain-damaged rats via an IL-8-mediated secretion mechanism rather than differentiation pattern induction〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；35(6)：2383-401.

13 杨美丽，黄银辉，姚 力，等.慢性间断性缺氧对大鼠脑缺血再灌注NF-κB及其靶基因TNF-α表达的影响〔J〕.第三军医大学学报，2014；36(12)：1303-6.

14 黄小平，卢金冬，丁 煌，等.黄芪和三七的主要有效成分配伍对脑缺血/再灌注小鼠NF-κB信号通路及炎性因子表达的影响〔J〕.中国药理学通报，2015；31(1)：141-6.

15 邓冰湘，卢金冬.NF-κB信号通路在脑缺血再灌注损伤中的作用及中药有效组(成)分的干预研究〔J〕.湖南中医药大学学报，2014；34(7)：54-8.

16 朱晓瓞，余资江，孙宝飞，等.NF-κB信号通路在小鼠脑缺血再灌注细胞凋亡中的作用〔J〕.中风与神经疾病杂志，2016；33(6)：484-8.

17 颜 因，谷依雪，刘 多，等.大鼠局灶脑缺血/再灌注中星形胶质细胞的反应和NF-κBp65、ICAM-1在星形胶质细胞中的表达〔J〕.内科急危重症杂志，2016；22(3)：219-24.

〔2016-08-31修回〕

(编辑 郭 菁)

史 冬(1971-)，女，副主任医师，主要从事神经内科脑血管病方面的研究。

R743

A

1005-9202(2017)10-2403-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.023

1 南阳市中心医院病理科