谭龙春 赵 亮 邓成敏 刘仙红 官志忠,

(贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

洛伐他汀上调体外培养神经细胞毒蕈碱型乙酰胆碱受体及对抗β-淀粉样肽对该受体表达的抑制作用

谭龙春1赵 亮2邓成敏1刘仙红3官志忠1,3

(贵州医科大学医学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

目的 观察洛伐他汀是否对毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChRs)有上调作用，探讨其是否具有抗β-淀粉样肽(Aβ)的作用。方法 选择原代培养的大鼠海马神经细胞和SH-SY5Y细胞，采用洛伐他汀和Aβ寡聚体(AβOs)分别或联合处理培养细胞24～48 h后，采用蛋白印迹法和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞中M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平。结果 免疫荧光染色显示原代大鼠海马神经细胞的体外培养纯度达85%以上;不同浓度洛伐他汀处理神经细胞24 h后，M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)；0.5 μmol/L AβOs处理神经细胞48 h后，其M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表达水平均明显下降(P<0.05)；但预先用0.1 μmol/L洛伐他汀处理神经细胞24 h，可减轻AβOs导致的M1 mAChR和M3 mAChR表达水平下降。结论 洛伐他汀可能具有上调mAChRs表达水平的作用，对抗Aβ对该受体的作用。

洛伐他汀；毒蕈碱型乙酰胆碱受体；β淀粉样肽

阿尔茨海默病(AD)主要的病理学特征是β-淀粉样肽(Aβ)沉积形成的老年斑(SPs) 和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结(NFTs)〔1〕，Aβ沉积和tau蛋白过度磷酸化也是导致神经元功能障碍的两个原因〔2〕。解剖学研究显示，AD患者基底前脑的胆碱能神经元特异性减少〔3〕。毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChRs，简称M受体)属于胆碱能神经递质性受体，参与认知功能的调节，与AD的发生密切相关〔4,5〕。Aβ可引起胆碱能神经系统损害，其机制主要有：抑制神经内源性乙酰胆碱(Ach)的释放和细胞对高亲和力胆碱的摄取，损害M受体与G蛋白的耦联，阻断M受体激动后的信号转导，使AChE降解速度减慢〔6〕。他汀类药物是胆固醇合成限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)抑制剂，能抑制胆固醇的合成，降低Aβ的生成〔7,8〕。本课题组之前的研究显示，低浓度的洛伐他汀处理SH-SY5Y细胞和星形胶质细胞，可上调α7 nAChR的表达〔9～11〕，但洛伐他汀是否也能上调mAChRs的表达并不清楚。本研究拟进一步分析洛伐他汀对抗Aβ的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及细胞 Sprague Dawley(SD)大鼠新生仔鼠(新生24 h 内)，由贵州医科大学实验动物中心提供，获得贵州医科大学伦理委员会批准进行实验(No.1311018)。原代大鼠海马神经细胞和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(由课题组保存)。

1.1.2 主要试剂 洛伐他汀、多聚赖氨酸、Aβ1～42购自Sigma公司(美国)；胎牛血清、Neurobasal-A 培养基、Hibernate-A培养基、B-27 添加剂、GlutaMAX添加剂购自Gibco公司(美国)；DMEM-F12培养基、0.25%胰蛋白酶、青霉素及链霉素购自Hyclone公司(上海)；BCA蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒、Trizol试剂、CY-3标记的羊抗小鼠IgG抗体和488标记的羊抗兔IgG抗体购自Thermo公司(美国)；SYBR green master 购自Roche公司(瑞典)；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司(日本)；裂解液、RIPA、5倍蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、显影定影试剂盒购自碧云天生物技术公司(上海)；山羊血清购自中杉金桥生物技术有限公司(北京)；M1 mAChR、M3 mAChR和β-actin引物序列购自生工公司(上海)；兔抗GFAP抗体购自Dako(丹麦)；鼠抗NeuN抗体、ECL试剂盒购自Millpore(美国)；兔抗M1 mAChR、M3 mAChR抗体购自Santa Cruz公司(美国)；兔抗β-actin购自Abmart公司(上海)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗购自Cell Signaling(美国)。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠海马神经细胞的培养 原代大鼠海马神经细胞培养参考Nunez〔12〕的方法，并根据实验室具体情况做了适当改动。新生SD乳鼠数只，75%酒精浸泡5 min，无菌条件下取头部，取出大脑，放入预冷的Hibernate-A培养基中，分离海马，并去除脑膜及血管。海马以D-Hank缓冲盐液清洗3次后，加入0.25% 胰蛋白酶37℃消化15 min，期间振摇3次；用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化1 min，弃培养基，D-Hank平衡盐液洗2次；加入2 ml含2%B27的Neurobasal-A完全培养基(含Neurobasal-A培养基、2%B27、1%GlutaMAX添加剂、100 U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素)，轻轻吹打细胞，避免产生气泡，自然沉淀后取上清；再加入 2 ml含2%B27的Neurobasal完全培养基，重复上述操作2次，得到细胞悬液，再用70 μm的滤网将细胞悬液过滤。吸取过滤后的细胞悬液，进行细胞计数。计数后用含2% B27的Neurobasal-A完全培养基稀释细胞，以5×105个/ml密度接种在经左旋赖氨酸(PLL)包被(用滤过除菌的0.01 mg/ml多聚赖氨酸室温包被过夜，PBS洗3次，晾干备用)过的6孔板内,于37℃，5% CO2培养箱中培养。每隔3 d以含2%B27的Neurobasal-A完全培养基半量换液。

1.2.2 原代大鼠海马神经细胞的鉴定 神经细胞培养至第7天时，弃培养液，加入PBS洗2次×3 min。每孔加入1 ml预冷4%多聚甲醛室温固定20 min，弃多聚甲醛，PBS洗3次×5 min，室温晾干；0.5%Triton X-100室温透膜处理20 min，PBS洗3次×5 min，晾干；10%山羊血清室温封闭30 min，弃山羊血清，每孔加500 μl PBS稀释一抗，含有小鼠抗NeuN抗体(1∶50)及兔抗GFAP抗体(1∶200)，阴性对照以PBS代替一抗，4℃过夜。吸出一抗，PBS洗3次×2 min，每孔加500 μl稀释二抗，含有Cy3(红光)标记抗小鼠IgG和488(绿光)标记抗兔IgG，室温避光孵育1 h，PBS洗2次×5 min；置于荧光倒置显微镜下观察，采集图片，计数10个视野内NeuN阳性及GFAP阳性细胞个数，计算神经细胞的纯度。

1.2.3 SH-SY5Y细胞的培养 从液氮罐中取出冻存的SH-SY5Y细胞，快速放入37℃水浴箱中摇动1～2 min使其快速融化，迅速转入含10 ml培养液的15 ml离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)的DMEM高糖培养基，用滴管轻轻吹打，使细胞重悬，然后把细胞悬液转入底面积为25 cm2(T25)的细胞培养瓶中，并放入37℃ 、5% CO2培养箱中培养。当细胞贴壁生长到80%后用0.25%胰蛋白酶消化传代。另外，可用细胞冻存液(90%胎牛血清，10%DMSO，现用现配)冻存细胞，然后将冻存细胞置于细胞梯度冻存盒内，放至-80℃过夜，次日转入-196℃液氮中保存。

1.2.4 细胞活性实验 采用CCK-8法检测细胞活性。原代培养神经细胞及SH-SY5Y细胞分别以1×105个/ml2浓度接种于96孔板中，不同浓度药物处理细胞，每个浓度设5个复孔，每孔加100 μl细胞悬液；培养至计划时间后，将每孔原始培养基取出，置换为不含血清及药物的纯培养基100 μl，空白对照组加入100 μl无细胞纯培养基，于每孔中加入10 μl CCK-8试剂，37℃孵育2 h，450 nm波长测定吸光度。

1.2.5 洛伐他汀处理细胞 SH-SY5Y细胞于6孔板中培养，生长至80%～90%，更换成无血清培养基培养12 h。原代大鼠海马神经细胞培养至第10天，弃B27培养2 h，分别加入不同浓度洛伐他汀(0.01 μmol/L和0.1 μmol/L)处理，24 h后加入0.5 μmol/L Aβ寡聚体(AβOs)；48 h后收集细胞，强效裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。

1.2.6 蛋白印迹法检测M1 mAChR和M3 mAChR蛋白表达水平 经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭后，分别用抗M1 mAChR(1∶1 000)、抗M3 mAChR(1∶1 000)抗体室温孵育1 h后4℃过夜。再加入HRP标记的抗兔二抗(1∶5 000)，室温振摇孵育1 h。将膜与ECL试剂反应后胶片曝光，所得胶片用扫描仪扫描，Image J软件分析结果。以β-actin蛋白条带灰度值作为内参，以目的蛋白和β-actin蛋白条带灰度值的比值进行校准，计算实验组与对照组相对蛋白表达水平差异。

1.2.7 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测M1 mAChR、M3 mAChR mRNA表达水平 采用一步法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行Real-time PCR。M1 mAChs、M3 mAChR及β-actin引物序列见表1。分析结果时以β-actin为内参照，应用RQ值(RQ=2-ΔΔCT)计算M1 mAChR、M3 mAChR基因在实验组与对照组的相对表达水平。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件行单因素方差分析(One-Way ANOVA)；进一步多重比较，方差齐性采用LSD-t检验，方差不齐采用DunnettT3分析。

2 结 果

2.1 原代大鼠海马神经细胞纯度鉴定 相差显微镜下原代大鼠海马神经细胞(图1)，经NeuN和GFAP免疫荧光双染后，可见NeuN阳性细胞，即神经细胞，激发后细胞核显红色荧光(图1)；GFAP阳性细胞，即星形胶质细胞，激发后，胞质显绿色荧光，胞核无色透明(图1)；未加抗体的阴性对照未观察到荧光(图1)。计数统计后，神经细胞纯度达到85%以上。

2.2 洛伐他汀细胞活性试验 1 μmol/L洛伐他汀作用于原代大鼠海马神经细胞及SH-SY5Y细胞24 h，可见细胞存活率显著低于对照组(设为100)(P<0.01)。所以在后面的研究中，选择0.01 μmol/L和0.1 μmol/L洛伐他汀，该浓度不影响细胞的存活率。见图2。

2.3 AβOs细胞毒性试验 0.5 μmol/L AβOs作用于原代大鼠海马神经细胞及SH-SY5Y细胞48 h，可见细胞存活率(设为100)显著低于对照组(P<0.01)。故在后面的研究中，选择0.5 μmol/L AβOs处理细胞。见图3。

2.4 洛伐他汀对M1 mAChR和M3 mAChR蛋白表达水平的影响 0.01和0.1 μmol/L洛伐他汀作用于原代大鼠海马神经细胞和SH-SY5Y细胞24 h后，M1 mAChR和M3 mAChR蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05)，见图4，表2。

图1 原代大鼠海马神经细胞免疫荧光染色(×200)

2.5 洛伐他汀对抗AβOs对M1、M3 mAChR蛋白表达水平的影响 0.5 μmol/L AβOs处理原代大鼠海马神经细胞和SH-SY5Y细胞48 h，与对照组相比，M1 mAChR及M3 mAChR蛋白表达水平均明显下降(P<0.05)；用0.1 μmol/L洛伐他汀预处理原代大鼠海马神经细胞和SH-SY5Y细胞24 h，可减轻AβOs导致的mAChRs蛋白表达水平下降。见图5，表3。

2.6 洛伐他汀对M1 mAChR及M3 mAChR mRNA表达水平的影响 0.01和0.1 μmol/L洛伐他汀作用于原代大鼠海马神经细胞24 h后，M1 mAChR及M3 mAChR mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。见表4。

2.7 洛伐他汀对抗AβOs对M1 mAChR及M3 mAChR mRNA表达水平的影响 0.5 μmol/L AβOs处理原代大鼠海马神经细胞48 h，与对照组相比，M1 mAChR、M3 mAChR mRNA表达水平明显下降(P<0.05)；用0.1 μmol/L洛伐他汀预处理原代大鼠海马神经细胞，可减轻AβOs导致的M1 mAChR、M3 mAChR mRNA表达水平下降。见表5。

图2 不用浓度洛伐他汀对原代大鼠海马神经细胞及SH-SY5Y细胞存活率的影响

图3 不用浓度AβOs对原代大鼠海马神经细胞及SH-SY5Y细胞存活率的影响

1、2、3分别为洛伐他汀0、0.01、0.1 μmol/L组图4 洛伐他汀对M受体蛋白表达水平的影响

组别SHSY5Y细胞M1mAchRM3mAchR原代海马神经细胞M1mAchRM3mAchR0μmol/L组100．00±4．17100．00±11．68100．00±15．0099．99±7．230．01μmol/L组114．93±4．661)146．07±3．111)154．01±31．231)161．80±9．691)0．1μmol/L组112．55±4．911)140．56±3．971)149．25±28．681)180．67±7．681)

与0 μmol/L组比较：1)P<0.05

表3 洛伐他汀对抗AβOs对SHSY5Y细胞及原代海马神经细胞中M1、M3 mAChR蛋白表达水平的影响±s)

与0 μmol/L组比较：1)P<0.05；与Aβ组比较：2)P<0.05

1：0 μmol/L洛伐他汀组；2：0.1 μmol/L洛伐他汀组；3：Aβ组；4：0.1 μmol/L洛伐他汀+Aβ组图5 洛伐他汀对抗AβOs对M受体蛋白表达水平的影响

组别M1mAchRM3mAchR0μmol/L组100．44±11．45100．31±9．790．01μmol/L组202．96±21．931)172．75±12．591)0．1μmol/L组205．22±19．931)178．45±10．781)

与0 μmol/L组比较：1)P<0.05

表5 洛伐他汀对抗AβOs对原代海马神经细胞M1、M3 mAChR mRNA表达水平的影响

与0 μmol/L组比较：1)P<0.05；与Aβ组比较：2)P<0.05

3 讨 论

他汀类药物作为一种降脂药，广泛用于降低血液中胆固醇水平；除此之外，他汀类药物也被认为是治疗和预防AD的潜在药物〔13〕。流行病学研究显示，服用他汀类药物治疗高血压和心脏病的老年人，痴呆和认知损害的发生率低于未服药人群，他汀类药物能够降低AD的发病风险〔14〕。动物模型研究显示，他汀类药物预防AD中作用机制可能包括减少Aβ〔15〕、β-位点APP切割酶(BACE1)水平及氧化应激〔16，17〕。

对于AD早期患者，连续1年给予胆碱酯酶抑制剂后发现，患者脑内的海马萎缩速率减半，表明胆碱能系统与神经退行性疾病关系密切〔18〕。影像学显示胆碱功能障碍与AD的病理过程及认知障碍有关〔19，20〕。长期使用抗胆碱能药物，特别是抗毒蕈碱药物，可以显著增加痴呆的发病风险〔21〕。G蛋白耦联受体能够调节与APP代谢有关的3种分泌酶的活性，从而调节APP代谢，影响Aβ生成；同时，Aβ通过负反馈机制也可以调节G蛋白耦联受体的活性〔22〕。mAChRs 属于G蛋白耦联受体，与胆碱功能失调、Aβ和Tau神经病理学等密切相关，选择性激活M1受体可延缓AD的发生和进展〔23〕。文献报道M1 mAChR与SPs和过度磷酸化的Tau蛋白的积累有关联〔24〕。此外，M1 mAChR阳性变构调节剂可以改善由于胆碱功能障碍引起的AD患者认知缺陷〔25〕。由于M1 mAChR与AD的发生发展有关，所以它被认为是AD治疗中的关键靶点。本实验发现洛伐他汀可显著提高M1 mAChR和M3 mAChR的蛋白及mRNA表达水平，提示洛伐他汀可刺激mAChRs的表达。上调mAChRs表达水平可改善AD患者的认知功能，对抗细胞凋亡，起到神经保护作用，同时也减少Aβ产生和tau蛋白过度磷酸化，从而延缓AD病程〔26,27〕。

Aβ是AD患者神经元细胞外淀粉样斑块的主要成分，是由APP经分泌酶剪切产生的一系列包括39～43个氨基酸的短肽，主要是Aβ40和Aβ42，其中Aβ42聚集性最强，有很强的神经毒性〔28〕。少量的Aβ能保护脑细胞，促进神经元的生长，但是过量的Aβ则会对神经元产生毒性，引起AD等神经性疾病的发生〔29〕。细胞内的Ca2+对细胞功能有极重要的作用，它是重要的细胞内第二信使，调节许多细胞反应和活动，参与神经递质释放、突触的可塑性等。Aβ可以增加细胞内Ca2+浓度，损害线粒体功能和细胞骨架，导致细胞损伤〔29〕。此外，Aβ可引起炎症反应，导致突触功能障碍和神经毒性作用，最终导致神经元变性或死亡〔30,31〕。这些研究均表明，Aβ可降低M1 mAChR、M3 mAChR蛋白和mRNA的表达水平。M1 mAChR、M3 mAChR表达减少，其与G蛋白的耦联作用和介导生成第二信使的能力下降，钙离子内流减少，抑制了神经递质的释放，进一步导致学习记忆能力减弱。此外，Aβ引起的胆碱能功能下降可减少APP营养分泌，增加Aβ分泌，影响M1受体的信号转导，抑制乙酰胆碱的合成和释放，进一步加剧了胆碱能缺乏〔32〕。而且洛伐他汀对于Aβ引起的M1 mAChR、M3 mAChR表达下降有缓解作用。综上所述，洛伐他汀可能具有上调mAChRs对抗Aβ的作用，这对寻找治疗AD的药物靶点提供了一定的理论依据。

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〔2016-11-19修回〕

(编辑 曲 莉)

Lovastatin may up-regulate expression of muscarinic acetylcholine receptors and against the neurotoxicity of β-amyloid peptide on the receptors

TAN Long-Chun,ZHAO Liang,DENG Cheng-Min,etal.

The Key Laboratory of Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the influence of lovastatin on muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs),and reveal whether the drug attenuate the inhibited effect of -amyloid peptide (Aβ) on the receptors.Methods The primary cultured rat hippocampal neurons and SH-SY5Y cells were exposed to lovastatin and Ab oligomers (AβOs) with alone or both treatments for 24～48 h. The protein levels of M1 and M3 mAChR were examined by Western blot,and the mRNA levels were tested by Real-time PCR.Results The purity of primary cultured rat hippocampal neurons was over 85%;by exposures of different concentrations of lovastatin for 24 h,the protein and mRNA levels of M1 and M3 mAChR were higher than those of control group,respectively (P<0.05);as compared with those of control group,the protein and mRNA levels of M1 and M3 mAChR were obviously decreased in the treatment with 0.5 μmol/L AβOs for 48 h (P<0.05); while the cells were pretreated with 0.1 μmol/L lovastatin for 24 h before the treatments by AβOs,the decreased protein and mRNA levels of M1 and M3 mAChR were all alleviated.Conclusions Lovastatin might up-regulate expression of mAChRs and attenuate the inhibited effect of Aβ on the receptors.

Lovastatin;Muscarinic acetylcholine receptors;β-amyloid peptide

国家自然科学基金( 81260173)；教育部“长江学者和创新团队发展计划资助”(IRT13058)；贵州省科技计划(黔科合重大专项字〔2014〕6008号)；贵州省创新计划项目(黔教合协同创新中心〔2014〕06)

官志忠(1951-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事阿尔茨海默病分子神经病理学研究。

谭龙春(1990-)，女，在读硕士，主要从事阿尔茨海默病分子神经病理学研究。

R741

A

1005-9202(2017)10-2363-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.008

1 省部共建地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室

2 贵州医科大学微生物学教研室 3 贵州医科大学附属医院病理科