韦俊杰 李吕力 李晓峰 李燕华 陈 渊 张丽香 范秉林 陈 志 封 浑

(广西壮族自治区人民医院神经内科，广西 南宁 530021)

依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑红蛋白和14-3-3γ蛋白的影响

韦俊杰 李吕力 李晓峰 李燕华 陈 渊 张丽香 范秉林 陈 志 封 浑

(广西壮族自治区人民医院神经内科，广西 南宁 530021)

目的 探索依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑红蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白的影响。方法 采用大脑中动脉闭塞法建立大鼠脑缺血再灌注模型，将48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和依达拉奉预处理组；采用酶联免疫吸附法检测血清Ngb和14-3-3γ水平，采用蛋白免疫印迹、免疫组化检测脑组织中Ngb和14-3-3γ表达。结果 模型组大脑和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手术组(P<0.05)，依达拉奉预处理组大脑和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于模型组(P<0.05)。结论 依达拉奉能通过上调脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中Ngb和14-3-3γ水平发挥脑保护作用。

依达拉奉；脑缺血再灌注；大脑中动脉闭塞；脑红蛋白；14-3-3γ蛋白

依达拉奉具有清除自由基、抗凋亡、抑制黏附因子等作用〔1，2〕。缺血性脑卒中最有效的治疗手段是超急性期的血管再通治疗(溶栓和取栓等)，但是血管再通后会出现缺血再灌注损伤，导致病情加重，而神经保护性蛋白能通过阻断脑缺血再灌注病理损害的发生，防止或减轻缺血引起的脑损害。脑缺血后会诱导脑红蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白等神经保护蛋白生成增多〔3〕。本实验拟探讨依达拉奉是否通过调节Ngb 和 14-3-3γ蛋白表达对脑缺血再灌注损伤起到神经保护作用。

1 材料和方法

1.1 动物和分组 健康清洁级成年雄性SD大鼠共48只，体重280～320 g，购于广西医科大学实验动物中心。将大鼠随机分为假手术组、模型组和依达拉奉预处理组，每组16只。

1.2 主要试剂 依达拉奉溶液由南京先声药业公司提供，规格5 ml∶10 mg。Ngb、14-3-3γ兔抗大鼠多克隆抗体分别购自武汉博士德、美国ABGENT公司，Ngb、14-3-3γ 的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购于武汉华美公司。

1.3 方法

1.3.1 制模及干预 模型组和依达拉奉预处理组采用石蜡线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后，将大鼠放在操作台上，仰卧固定四肢，取颈部正中切口，剪毛消毒皮肤，剪开皮肤并钝性分离组织肌肉，动作轻柔避免损伤刺激迷走神经，暴露颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉,结扎颈外动脉，从颈总动脉插线栓入颈内动脉，深度约20 mm，丝线固定，清创缝合伤口。缺血 2 h后再缓慢拔出栓子，使栓子头端回到颈总动脉内即可。假手术组仅暴露右侧颈总动脉后缝合，不做其余处理。依达拉奉预处理组于术前3 d开始，每日3 ml/kg体重分两次腹腔注射依达拉奉溶液，直至动物解剖。假手术组和模型组均于同时间段腹腔注射等体积的生理盐水。

1.3.2 神经功能评分 参照5分制评分标准,待大鼠麻醉清醒后予以评分。0分，没有神经功能缺失症状；1 分，轻度局灶性神经功能缺损(不能够完全伸展左侧前肢)；2分，中度局灶神经功能缺损(向左侧转圈)；3分，重度神经功能缺损(向左侧倾斜)；4分，不能够自发行走，意识水平降低。1～3分为模型制作成功，剔除死亡与不成功的动物并重新选取SD大鼠制模成功后补充。

1.3.3 血清采集及检测 缺血再灌注24 h后用3.5%水合氯醛(10 ml/kg)腹腔注射麻醉后经心脏取静脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min后分离血清，-80℃冰箱保存备用。

1.3.4 ELISA 血清Ngb和14-3-3γ浓度检测采用ELISA试剂盒按说明书进行操作。在450 nm波长测量光密度值(OD值)。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用Curve Exert1.3软件制作标准曲线并计算出样本的实际浓度值。

1.3.5 苏木素-伊红(HE)染色 随机取10只大鼠麻醉后经左心室插管灌注生理盐水，继以4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)灌注，待灌注充分后解剖分离出大脑，将大脑浸泡在4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，逐级予乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片行HE染色。经脱蜡、脱水、苏木素染色、伊红液染色、封片后，置于200倍光学显微镜下观察大脑梗死灶周边区域。

1.3.6 免疫组化 取上述蜡块行4 μm连续切片，经脱蜡，脱水，抗原修复，血清封闭后，加入抗Ngb(1∶200)、抗14-3-3γ(1∶100)的一抗，4℃孵育过夜。加生物素标记二抗孵育，清洗后再加辣根酶标记的链霉卵白素工作液孵育，二氨基联苯胺(DAB)显色后在光学显微镜下观察。阴性对照除以PBS代替一抗外，余步骤相同。阳性表达为细胞质内出现棕黄色颗粒。选取梗死灶周边的5个随机视野(40×10倍)，用Image pro-plus 6.0软件对选定的视野进行半定量检测，测定每个视野的积分光密度值(IOD)和阳性面积(area)，计算平均积分光密度(IOD/area)。

1.3.7 蛋白免疫印迹 随机取6只大鼠，麻醉后立即冰上取脑组织，加组织裂解液后匀浆、离心后提取总蛋白，考马斯亮蓝法定量蛋白,取5 μg 蛋白加入SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，确定片段大小后，电印迹转染到聚偏氟乙烯膜，封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)室温1 h，继之用目的蛋白Ngb(1∶5 000)、14-3-3γ(1∶5 000)和GAPDH(1∶10 000)的一抗4℃过夜孵育，TBST冲洗，再用结合辣根过氧化物酶的二抗孵育。化学发光法显现蛋白带，拍照，用 Lab4.3对条带进行密度分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0软件行成组t检验、单因素方差分析；两组间差异比较当方差齐时采用SNK检验，方差不齐时采用Games-Howell检验。

2 结 果

2.1 HE染色结果 假手术组脑组织HE染色未见病理性改变。模型组的梗死灶内可见大量细胞坏死,组织溶解后留下空洞，梗死灶周围均可见细胞数明显减少、细胞肿胀,部分细胞的细胞核固缩、深染或溶解。依达拉奉预处理组梗死灶周围的病理性损伤比模型组明显减轻。见图1。

2.2 血清Ngb 和14-3-3γ的浓度 模型组血清Ngb和14-3-3γ的浓度均高于假手术组(P<0.05)，而依达拉奉预处理组血清Ngb和14-3-3γ浓度均高于模型组(P<0.05)。见表1。

图1 3组脑组织HE染色结果(×200)

组别Ngb14⁃3⁃3γ假手术组4123±794027±005模型组6694±11201)057±0101)依达拉奉预处理组11384±56701)2)095±0391)2)

与假手术组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.3 大脑Ngb和14-3-3γ的免疫组化表达 模型组大脑梗死灶附近的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手术组(P<0.05)。相对于模型组，依达拉奉预处理组大脑的Ngb和14-3-3γ水平均明显升高(P<0.05)。见表2，图2，图3。

2.4 大脑Ngb和14-3-3γ的蛋白表达 模型组患侧大脑的Ngb和14-3-3γ蛋白表达均高于假手术组(P<0.05)。依达拉奉预处理组大脑的Ngb和14-3-3γ蛋白表达相对模型组均明显升高(P<0.05)。见图4，表3。

表2 3组大脑Ngb 和14-3-3γ的免疫组化表达

图2 3组脑组织Ngb免疫组化(DAB，×200)

图3 3组脑组织14-3-3γ免疫组化(DAB，×200)

组别Ngb14⁃3⁃3γ假手术组046±011035±016模型组068±0181)057±0211)依达拉奉预处理组094±0231)2)086±0241)2)

3 讨 论

缺血性脑血管病病理生理机制复杂，其中脑缺血后再灌注损伤危害极大，脑缺血恢复血液再灌注后,其病理损伤反而进一步加重，而神经保护性蛋白能通过抑制凋亡等作用，从而防止或减轻缺血再灌注引起的脑损害，减少脑组织死亡和促进组织修复〔4〕。本研究结果说明依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用，进一步研究发现，依达拉奉能促进脑缺血再灌注大鼠脑组织Ngb和14-3-3γ的生成。

14-3-3γ蛋白主要表达在中枢神经系统的星型胶质细胞和神经元中，研究发现，脑梗死患者梗死灶的14-3-3γ蛋白表达明显升高，提示14-3-3γ蛋白在脑梗死灶发挥着重要作用〔5〕。在体外缺血模型中，14-3-3γ蛋白能抑制缺氧缺糖条件下神经元或星型胶质细胞的病理损伤及死亡〔6，7〕，本研究发现，依达拉奉能提高脑缺血灶的14-3-3γ蛋白表达，说明其脑保护作用机制之一是上调14-3-3γ的表达。Ngb是主要存在于神经系统内的一种携氧球蛋白,类似于血红蛋白、肌红蛋白等，可以和氧气、二氧化碳等多种气体配体结合，但Ngb比血红蛋白对氧具有更高的亲和力〔8〕。通过人脑组织的免疫组化研究发现，脑卒中患者缺血半暗带脑组织的Ngb表达较正常对照明显增高〔9〕。Khan等〔10〕研究发现，过表达的Ngb能有效减少缺血再灌注小鼠的脑梗死面积，说明Ngb对缺血性脑卒中具有脑保护作用。本研究也说明其脑保护作用机制之一是促进Ngb的生成。

依达拉奉对Ngb和14-3-3γ的调节作用可能涉及以下机制：Ngb既是中枢神经系统的携氧球蛋白，又是氧自由基的清除剂〔11〕；依达拉奉能清除缺血再灌注后的氧自由基，从而减少氧自由基对Ngb的消耗，促进Ngb的高表达。14-3-3γ蛋白在脑缺血再灌注中多作为一种信号传导相关分子发挥作用〔3〕，Ye等〔12〕学者研究发现，沉默Ngb的表达会下调氧化损伤后神经细胞的14-3-3γ表达，说明Ngb对14-3-3γ的表达有促进作用。本研究中依达拉奉可上调脑缺血再灌注大鼠的脑组织14-3-3γ的表达，该作用机制可能与其上调Ngb表达进而促进14-3-3γ的生成有关。

通过本次研究发现，依达拉奉能上调脑缺血再灌注大鼠血清和大脑的Ngb和14-3-3γ蛋白表达，从而发挥神经保护作用。然而本研究主要是体内试验，还需完善体外试验进一步了解依达拉奉的调节机制，以期发现更多脑缺血的有效治疗靶点和作用机制。

1 Kikuchi K,Tancharoen S,Takeshige N,etal.The efficacy of edaravone (radicut),a free radical scavenger,for cardiovascular disease〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(7):13909-30.

2 李吕力,韦俊杰,李晓峰,等.依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠血管细胞黏附分子1的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2015;17(5):519-21.

3 Dong Y,Zhao R,Chen XQ,etal.14-3-3gamma and neuroglobin are new intrinsic protective factors for cerebral ischemia〔J〕.Mol Neurobiol,2010;41(2-3):218-31.

4 Nour M,Scalzo F,Liebeskind DS.Ischemia-reperfusion injury in stroke〔J〕.Interv Neurol,2013;1(3-4):185-99.

5 Kawamoto Y,Akiguchi I,Tomimoto H,etal.Upregulated expression of 14-3-3 proteins in astrocytes from human cerebrovascular ischemic lesions〔J〕.Stroke,2006;37(3):830-5.

6 Lai XJ,Ye SQ,Zheng L,etal.Selective 14-3-3γ induction quenches p-β-catenin Ser37/Bax-enhanced cell death in cerebral cortical neurons during ischemia〔J〕.Cell Death Dis,2014;5(4):e1184.

7 Ying P,Chao RC,Kai G,etal.Ischemia preconditioning protects astrocytes from ischemic injury through 14-3-3γ〔J〕.J Neurosci Res,2015；93(10):1507-18.

8 Burmester T,Weich B,Reinhardt S,etal.A vertebrate globin expressed in the brain〔J〕.Nature,2000;407(6803):520-3.

9 Kunlin J,Ying M,Xiao M,etal.Neuroglobin expression in ischemic stroke〔J〕.Stroke,2010;41(3):557-9.

10 Khan AA,Wang Y,Sun Y,etal.Neuroglobin-overexpressing transgenic mice are resistant to cerebral and myocardial ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2006;103(47):17944-8.

11 Shang A,Yang Y,Wang H,etal.Upregulation of neuroglobin expression and changes in serum redox indices in a rat model of middle cerebral artery occlusion〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(2):1693-8.

12 Ye SQ,Zhou XY,Lai XJ,etal.Silencing neuroglobin enhances neuronal vulnerability to oxidative injury by down-regulating 14-3-3gamma〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2009;30(7):913-8.

〔2016-06-07修回〕

(编辑 郭 菁)

Effect of edaravone on neuroglobin and 14-3-3γ protein in rats with middle cerebral artery ischemia-reperfusion

WEI Jun-Jie,LI Lü-Li,LI Xiao-Feng,etal.

Department of Neurology,Guangxi Zhuang Autonomous Region People's Hospital,Nanning 530021,Guangxi,China

Objective To explore the effect of edaravone on neuroglobin(Ngb) and 14-3-3γ protein in rats with middle cerebral artery ischemia-reperfusion(I/R).Methods Rat model of I/R and reperfusion were established by the cerebral artery occlusion method. 48 male SD rats were randomly divided into sham operation,model and edaravone-pretreated groups. The expressions of Ngb and 14-3-3γ were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),immunohistochemistry and Western blot.Results The Ngb and 14-3-3γ levels of brain and serum in model group were higher than those of sham operation group (P<0.05),while Ngb and 14-3-3γ expressions were higher in edaravone-pretreated group compared to those of model group (P<0.05). Conclusions Edaravone has a protective effect against middle cerebral artery I/R by enhancing Ngb and 14-3-3γ.

Edaravone;Cerebral ischemia-reperfusion;Cerebral artery occlusion;Neuroglobin;14-3-3γ protein

国家自然科学基金(81460192);广西自然科学基金项目(2011GXNSFA018185)

李吕力(1959-)，男，主任医师，硕士生导师，主要从事脑血管疾病研究。

韦俊杰(1987-)，男，硕士，住院医师，主要从事脑血管疾病研究。

R743.3

A

1005-9202(2017)10-2394-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.004