邓茹云 刘 楠 朴美花 李绍臣 刘 明 冯春生

(吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021)

七氟烷对APP/PS1双转基因小鼠海马神经元蛋白质损伤和聚集的影响

邓茹云1刘 楠 朴美花 李绍臣1刘 明2冯春生

(吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021)

目的 探讨吸入麻醉药七氟烷对APP/PS1双转基因小鼠海马组织神经元蛋白质损伤和聚集的影响。方法 12月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为两组各30只：对照组小鼠给予2 L/min氧气吸入4 h；七氟烷组小鼠给予2%七氟烷吸入麻醉4 h。部分小鼠麻醉后6 h应用末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)法检测海马神经元凋亡情况，应用二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测活性氧(ROS)水平；部分小鼠麻醉后24 h应用免疫组织化学法(IHC)和Western印迹法检测海马神经元内氧化损伤蛋白质(蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42)的表达，应用TEM观察海马神经元内蛋白质聚集物。结果 七氟烷组小鼠海马神经元凋亡率、ROS水平、蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42的表达水平均高于对照组，蛋白质聚集物增多(P<0.05)。结论 12月龄APP/PS1双转基因小鼠给予2%七氟烷麻醉4 h，能够加剧其海马神经元氧化应激损伤，促进蛋白质损伤和聚集，诱导海马神经元凋亡，加重阿尔茨海默病(AD)的神经病理损害。

七氟烷；蛋白质损伤；蛋白质聚集；细胞凋亡；神经毒性

蛋白质聚集是伴随阿尔茨海默病(AD)神经元变性过程的主要病理特征之一，研究表明β淀粉样蛋白(Aβ)、tau蛋白和氧化损伤蛋白等蛋白质毒性聚集能够激活凋亡相关级联信号通路，导致神经元凋亡，加重AD的神经病理损害〔1～4〕。研究发现全身麻醉与AD的发生发展密切相关，麻醉药七氟烷能够诱导海马神经元凋亡，引起认知功能损害，加重AD神经病理进程〔5,6〕，但其机制是否与诱导海马神经元中异常蛋白质损伤和聚集相关还不清楚。本研究应用APP/PS1双转基因小鼠，探讨吸入麻醉药七氟烷对AD小鼠海马组织神经元中蛋白质损伤和蛋白聚集的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 12月龄APP/PS1双转基因小鼠购自中国医学科学院医学实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心，雌雄各半，标准实验室条件(白天/黑夜12 h∶12 h，温度18℃～25℃,湿度60%，4～5只/笼)饲养。七氟烷购自中国上海雅培公司；末端脱氧核苷酸转移酶(TUNEL)试剂盒购自瑞士Roche公司；二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)购自美国Sigma公司；小鼠β-actin、抗核抗体(DNP)、抗Nitrotyrosin抗体以及抗Aβ42抗体均购自美国Abcam公司。

1.2 分组 小鼠随机分为两组各30只，对照组小鼠置于持续通入2 L/min氧气的麻醉箱中4 h；七氟烷组小鼠置于麻醉箱中给予2%的七氟烷麻醉4 h。麻醉箱中放置二氧化碳吸收剂、加温毯和红外线灯，麻醉过程中小鼠保持自主呼吸，监测肛温、血压、心率和血氧饱和度。应用红外线吸收装置监测麻醉箱流出气体中七氟烷、氧气和二氧化碳的浓度。麻醉后吸入纯氧3 L/min，小鼠翻正反射恢复20 min后提示苏醒，将所有小鼠放回其各自笼中。

1.3 海马神经元凋亡检测 麻醉后6 h，两组分别随机抽取6只小鼠，腹腔注射麻醉药后暴露心脏，冰冷磷酸盐缓冲液(PBS)穿心灌注直至肝脏颜色变白，迅速取鼠脑，沿中线将其分为左右两部分。左半脑组织先于干冰中冷冻5 min，-80℃储存。右半脑组织经4%多聚甲醛固定后行石蜡包埋、切片(4 μm)。切片于室温下经过常规脱蜡水合后依照TUNEL试剂盒说明书，应用TUNEL试剂盒依次操作。应用光学显微镜观察海马组织切片中神经元凋亡情况。

1.4 海马神经元内活性氧(ROS)水平检测 将小鼠左半海马组织从-80℃冰箱中取出，加入匀浆缓冲液后离心，取上清液与10 μmol/L的DCFH-DA工作液混合，37℃孵育20 min，PBS冲洗3次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，最后经离心去上清后获得目的细胞，检测细胞内DCFH荧光强度。

1.5 免疫组织化学法(IHC)检测海马神经元内氧化损伤蛋白质蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42表达水平 麻醉后24 h，两组分别随机抽取6只小鼠，腹腔注射麻醉药麻醉后暴露心脏，冰冷PBS穿心灌注直至肝脏颜色变白，迅速取鼠脑，沿中线将其分为左右两部分。左半脑组织-80℃储存，右半脑组织经4%多聚甲醛固定后行石蜡包埋、切片(4 μm)。切片经常规脱蜡、水化、抗原热修复后再经PBS冲洗，滴加牛血清白蛋白，去除多余液体后分别滴加抗DNP抗体、抗Nitrotyrosin抗体和抗Aβ42抗体，4℃冰箱中孵育过夜，PBS冲洗后滴加二抗，37℃湿盒中孵育30 min，PBS冲洗后滴加锭霉卵白介素+辣根酶标记生物素(SABC)，37℃孵育30 min，PBS冲洗后滴加二氨基联苯胺(DAB)，蒸馏水冲洗后苏木素复染，脱水封片。应用光学显微镜观察海马神经元内蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42的表达。

1.6 检测Western印迹法 海马神经元内蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸蛋白和Aβ42表达水平 将小鼠左半海马组织从-80℃冰箱中取出，加入细胞裂解液15 min后离心，取其上清液，应用二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒分别测定各待检蛋白质浓度，确定上样量后依次进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳、转膜、封闭1 h后Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜，分别加入抗DNP抗体、抗Nitrotyrosin抗体和抗Aβ42抗体，孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗，室温孵育1 h后TBST洗膜，最后聚偏氟乙烯(PVDF)膜经发光显色处理并压片成像。β-actin作为内参照，以样本中目标条带光密度与相应内参光密度的比值反映各蛋白质表达水平。

1.7 海马神经元内蛋白质聚集物检测(透射电镜法) 麻醉后24 h，两组各随机抽取6只小鼠，杀鼠取其海马组织，置于2.5%戊二醛低温(4℃)固定过夜，经PBS充分漂洗后再置于1%锇酸固定2 h，蒸馏水充分漂洗后再依次进行不同浓度的乙醇逐级脱水和包埋固化，最后应用超薄切片机切片，超薄切片(120 nm)经醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，应用透射电镜观察海马神经元各蛋白质聚集物。

1.8 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 两组海马神经元凋亡情况 对照组海马神经元凋亡率(29.4%±4.5%)显著低于七氟烷组(39.7%±5.5%，P<0.05)。见图1。

2.2 两组海马神经元内ROS水平比较 与对照组(767.1±72.4)比较，七氟烷组小鼠海马神经元中DCF荧光强度(1 050.5±104.8)明显增加(P<0.05)，代表ROS水平增高。

2.3 IHC检测两组海马神经元内蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表达水平 七氟烷组海马神经元内可见大量氧化损伤蛋白质表达，与对照组比较，蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白的表达水平显著增高(P<0.01)。见图2和图3。

图1 两组海马神经元凋亡情况(TUNEL法，×400)

图2 两组小鼠海马组织蛋白羰基化合物表达水平(IHC，×40)

图3 两组小鼠海马组织硝基化酪氨酸蛋白表达水平(IHC，×40)

2.4 Western印迹检测两组海马神经元内蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表达水平 对照组与七氟烷组小鼠海马组织中蛋白羰基化合物的表达水平分别为(21.2%±4.8%)和(92.3%±11.4%)，硝基化酪氨酸蛋白的表达水平分别为(28.3%±5.5%)和(87.7%±10.6%)；与对照组比较，七氟烷组小鼠海马组织中蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白的表达均显著增高(P<0.01)。见图4。

2.5 透射电镜检测两组海马神经元内蛋白质聚集物 透射电镜下可见七氟烷组小鼠海马组织切片中神经元内存在大量蛋白质聚集物，与对照组比较，七氟烷组小鼠海马神经元中蛋白质聚集水平明显增高(P<0.01)。见图5。

2.6 两组海马神经元Aβ42表达水平比较 IHC和Western印迹检测结果均显示七氟烷组小鼠海马CA1区Aβ42的表达(72.4±9.1)较对照组(22.3±4.75)明显增高(P<0.01)。见图6，图7。

图4 两组小鼠海马组织蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表达水平(Western印迹)

图5 两组小鼠海马神经元中蛋白质聚集电镜检测结果

图6 两组小鼠海马CA1区Aβ42表达水平(IHC，×400)

图7 两组小鼠海马CA1区Aβ42表达水平(Western印迹)

3 讨 论

氧化应激损伤在AD发病机制中发挥重要作用，研究显示氧化应激能够引起ROS生成增加，ROS具有高度的氧化活性，AD脑内蛋白质能被ROS氧化，发生羰基化和硝基化修饰，生成蛋白质羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白〔7～9〕。氧化损伤时蛋白质经不可逆的羰基化修饰生成蛋白质羰基化合物，能够导致羰-氨反应,使蛋白质发生分子内或分子间的交联，影响其正常的结构和功能，导致蛋白质毒性聚集。研究发现AD时，海马组织中神经元和神经胶质细胞中氧化蛋白羰基化合物含量增加，蛋白质羰基化在老年斑和神经原纤维缠结形成过程中发挥重要作用，与AD神经病理进程相关〔8〕。蛋白质硝基化修饰即氧化应激时特定蛋白质酪氨酸残基发生硝基化反应，生成毒性代谢产物硝基化酪氨酸蛋白，改变了原蛋白质结构，影响其生理功能，导致凋亡相关的信号通路活化，诱导细胞凋亡〔9〕。蛋白质羰基化和酪氨酸硝基化是AD病理机制中上游分子病因。因此，蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白的检测已成为判定AD神经病理进程中氧化应激损伤的主要指标。

蛋白质聚集是AD神经元变性过程的主要病理特征之一，大量异常蛋白(Aβ、Tau和氧化损伤蛋白等)的毒性聚集能够活化凋亡相关级联信号通路，介导AD 病理机制〔3〕。Aβ在AD的发病机制中发挥核心作用，由淀粉样前体蛋白经β、γ等分泌酶裂解而形成，沉积于大脑皮层和海马等脑区细胞外形成老年斑，其中Aβ42神经毒性更强、更容易聚集，对AD发病具有重要意义。AD时Aβ聚集能够直接损伤线粒体，导致能量代谢障碍，释放细胞色素C并激活caspase-3等凋亡因子，引起神经元凋亡。此外，Aβ聚集能够引起氧化应激，ROS病理性增高致使氧化损伤蛋白质羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白表达异常增加，诱导Aβ等蛋白质过度聚集；同时，蛋白质聚集过程中产生ROS，进一步加重氧化应激，形成恶性循环，导致神经元变性和凋亡，加剧AD神经病理进程〔3,10,11〕。

吸入麻醉药七氟烷是目前最常用全身麻醉药物，研究显示七氟烷暴露能够导致海马等脑区神经元凋亡，引起学习记忆损伤，加剧病情进展〔3,6〕。研究发现3%七氟烷麻醉6 h能够增加AD脑内Aβ42等蛋白质聚集和tau蛋白磷酸化，激活caspase级联凋亡信号通路，引起神经元凋亡〔12〕。本研究结果表明临床相关浓度七氟烷麻醉能够与神经变性相关蛋白质相互作用，促进Aβ42生成和聚集，诱导细胞凋亡。研究表明，七氟烷暴露能够降低细胞存活率，活化caspase-3，增强bax表达，抑制bcl-2表达，增加Aβ表达水平，促进神经元凋亡〔12,13〕。动物研究显示2%七氟烷麻醉5 h能够诱导18月龄SD大鼠海马内质网应激和神经元凋亡相关信号通路的活化，引起其认知功能损害〔3〕。本研究结果表明七氟烷具有AD相关神经毒性，七氟烷暴露能够诱导AD小鼠海马神经元中ROS生成增加，加剧氧化应激损伤，增加氧化损伤相关蛋白羰基化合物和硝基化酪氨酸蛋白生成，促进Aβ42毒性聚集，诱导神经细胞凋亡，促进AD神经病理损害。

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〔2016-11-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

Effects of the neuronal protein damage and aggregation induced by inhaled anesthetic sevoflurane in the APP/PS1 transgenic mouse hippocampus

DENG Ru-Yun,LIU Nan,PIAO Mei-Hua,etal.

Department of Anesthesiology,First Hospital of Jilin University,Changchun 130021,Jilin,China

Objective To investigate the effects of the neuronal protein damage and aggregation induced by inhaled anesthetic sevoflurane in the APP/PS1 transgenic mice hippocampus.Methods 60 APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into control and sevoflurane groups. TUNEL and DCFH-DA were applied to detect the hippocampal neuronal apoptosis and ROS level respectively,immunohistochemical method and Western blot were applied to detect Aβ42 level,carbonyl compounds and nitrotyrosine,TEM was applied to observe the protein aggregation.Results Compared with those of control group,the neuronal apoptosis rate,expression levels of ROS,Aβ42,oxidative protein carbonyl compounds and nitrotyrosine were significantly increased in sevoflurane group(P<0.05).Conclusions 2% sevoflurane exposure for 4 hours significantly aggravates the oxidative-stress injury of hippocampal neuron,hippocampal protein damage and aggregation,guides neuronal apoptosis,exacerbates neuropathology injury.

Sevoflurane;Protein damage;Protein aggregation;Apoptosis;Neurotoxicity

国家自然科学基金资助课题(No.81271215,81141065)；吉林省科技发展计划项目(No.20150101170JC)；中国博士后科学基金项目(No.2016M591489)

冯春生(1971-)，男，教授，硕士生导师，主要从事麻醉对脑功能和脑疾病的影响及相关机制研究。

邓茹云(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事全身麻醉药物对阿尔茨海默病发病机制的研究。

R614.21

A

1005-9202(2017)10-2344-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.002

1 大庆油田总医院麻醉科 2 吉林省前卫医院