张丽娟，王玮，谢玉清，张志东，顾美英，朱静，唐琦勇，王博，宋素琴

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)



新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病病原菌的分离与鉴定

张丽娟，王玮，谢玉清，张志东，顾美英，朱静，唐琦勇，王博，宋素琴

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091)

【目的】研究新疆吉木萨尔大蒜种植区大蒜根腐病的病原菌。【方法】采用常规组织分离法分离纯化病原菌，用传统的形态学鉴定方法，结合分子生物学方法对菌株进行鉴定。用原位伤根法进行回接，对照科赫法则明确致病菌的种类及其致病力。【结果】在采集的3批次典型病害植株组织和根际土壤中分离得到64株分离物，其中61株分属于镰刀菌，分属于尖孢镰刀菌、层生镰刀菌、芳香镰刀菌、三线镰刀菌、轮状镰刀菌和木贼镰刀菌。尖孢镰刀菌和层生镰刀菌分离频率累计达到76.6%，且在采集的各个时期都有分离出现。选取典型的5株菌株进行回接测定，回接的5个镰刀菌种均表现出不同程度的致病性，其中尖孢镰刀菌是大蒜根腐病分离频率最高、且致病性最强的致病菌，其次为层生镰刀菌。【结论】新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病是由镰刀菌属的真菌引起的，其中尖孢镰刀菌是致病的优势种。

大蒜；根腐病；尖孢镰刀菌；致病性

0 引 言

【研究意义】新疆是中国传统四大名蒜“新疆白皮蒜”的原产地。新疆大蒜的种植主要集中在天山北坡逆温带的吉木萨尔、奇台、木垒以及焉耆、塔城等地。吉木萨尔地区的“绿嘴白皮蒜”，以其皮薄瓣匀、口感辛辣、耐贮存等优良品质，在市场上占有一定份额。近年来，大蒜价格居高不下，产量供不应求，促使大蒜的种植规模在不断扩大。在连作、管理不善、种质退化以及气候条件不利等原因的影响下，大蒜的病虫害也呈现高发趋势。在吉木萨尔大蒜种植区自2012年以来出现大蒜根腐型病害，该病害作用时间长、发病范围广、防治较为困难、危害也最为严重[1]。但至今对该地区大蒜根腐病病原菌系统的研究尚未见报道。研究大蒜根腐病病原菌的种类及其优势种，有利于深入研究病害的发生机理和发病规律，对该病害的科学防治具有重要意义。【前人研究进展】作物的根腐病是一类发病原因复杂，防止极为困难的土传病害。根腐病往往由多种病原菌混合侵染造成，例如牡丹根腐病病原菌是茄腐皮镰刀菌(Fusariumsolani)、链格孢菌(Alrernariaspp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)等，同时茄腐皮镰刀菌也是甜瓜、黄瓜、苜蓿等作物的根腐病病原菌[2,3]。草莓的根腐病病原菌主要是丝核菌(Rhizoctoniaspp.)、镰刀菌(Fusariumspp.)和轮枝菌(Verticliliumspp.)等[4-6]。Carlucci等[7]认为球壳属真菌(Sphaerulina)是造成意大利园艺作物根腐病的主要病原。桑紫纹羽病菌(Helicobasidiummompa)是韩国紫云英根腐病的主要病原菌[8]。2006和2007年邳州、徐州、陕西兴平、武功蒜区发生大蒜根腐病，病害大蒜产量和质量明显下降。根据相关报道，张博等[9]研究认为该病害主要由腐霉菌引起，而刘留和李程玉等[10,11]则认为该病害由细菌引发。可见，不同地区大蒜根腐病的发病原因和病原菌也不尽相同。在新疆，已报道有根腐病发生的作物有在大豆、花芸豆、加工辣椒、番茄、苜蓿、雪莲、棉花、甜瓜和小麦等，根腐病已经给新疆农业生产带来了巨大的损失。【本研究切入点】近年来，吉木萨尔地区大蒜根腐病呈现高发趋势，给蒜农造成极大经济损失，成为当前制约新疆大蒜生产的主要因素之一。目前尚未有关于该地区大蒜根腐病病原、发病规律及病害防治的相关报道。研究新疆吉木萨尔大蒜种植区大蒜根腐病的病原菌。【拟解决的关键问题】研究吉木萨尔地区大蒜根腐病典型病害样本，并进行病原菌的分离鉴定，明确该病的致病菌种类及优势致病菌，为新疆大蒜种植区大蒜根腐病的科学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

病原菌分离用的大蒜采自吉木萨尔新地乡大蒜连作田。分别于2013年8月、2014年8月、2015年8月分3批次采样挖取，筛选具有典型根腐病性状的蒜株，置于保鲜袋内4℃，送回实验室后立即进行病原菌分离。

培养基：PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基/potato dextrose agar )：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15～20 g，水1 000 mL。121℃灭菌20 min。WA(2%水琼脂培养基)自来水1 000 mL，琼脂20 g。121℃灭菌20 min。SNA培养基(Spezieller Nährstoffarmer 琼脂培养基)KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO31 g，KH2PO41 g，蔗糖0.2 g，葡萄糖0.2 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL。121℃灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分离纯化

将患病大蒜植株尤其是根系在流水下冲洗干净。采用常规组织分离法切取不同时期采集的大蒜病株患病部位的病健交界部分，大小为5 mm×5 mm。表面消毒：首先用75%乙醇浸泡30 s，然后用HgCl2浸泡30 s，无菌水冲洗3次，置于PDA平板上，28℃培养3 d。

取鉴定为镰刀菌属的培养物的菌落边缘，置于SNA培养基上，促进镰刀菌产孢。待孢子产生后，制备孢子悬液用单孢分离法在WA板上获得纯化培养物。纯化后的菌株用PDA斜面，4℃保存。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 形态学

将纯化后的菌株分别置于PDA、WA和SNA培养基上，28℃，培养4 d后测量PDA培养基上的菌落直径，计算生长速度，10 d后分别观察3种培养基上的菌落菌丝形态和颜色。显微镜下观察孢子及产孢结构，以及厚垣孢子的有无、大小、形态等特征。参照《真菌志》、《真菌鉴定手册》、《常见镰刀菌鉴定手册》，进行形态学鉴定。

1.2.2.2 分子生物学

分离得到的典型菌株在PDA平板上培养10 d左右，刮取收集菌丝，利用CTAB法提取基因组DNA。采用真菌通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行扩增。PCR反应体系为：2×Mix25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O至50 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸50 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，DNA片段经胶回收试剂盒回收测序，测序结果与GenBank登录的镰刀菌属及相近属的序列进行比对分析。

1.2.3 分离菌株的致病性测定

根据分离菌株的分类鉴定结果，选取代表性的菌株YF2-1，YF2-4，YF2-6，YF2-19，YF2-34，YF3-2，YF4-2接种于PDA液体培养基中28℃，160 r/min震荡培养7 d，纱布过滤除去菌丝体，滤液5 000 r/min离心10 min得到孢子悬浮液。用无菌水稀释至1×106个孢子/mL。

病原菌回接采用伤根法。接种前适当浇水保持基质湿润，用玻璃棒在距幼苗根茎约2 cm处扎一个孔，小心暴露出幼苗的部分根茎，用无菌刀片在根须处制造一个小伤口，将25 mL孢子悬液灌入孔内，对照组接无菌的PDA培养液。每个菌株至少3次重复。观察接种后的发病情况。

根据科赫法则，对发病植株进行病原菌的再次分离。根据发病程度制定5级分级标准，统计发病情况和病情指数。

0级：植株完整健康，根系健康，蒜头健康表皮红，无发病。

1级：植株健康，根系健康，蒜头尚且健康但表皮变黑，茎基部变黑。

2级：植株叶子变黄，根系较弱，蒜头小且表皮变黑，茎基部变黑，略软腐。

3级：植株矮小，叶子变黄；根系短小软腐，蒜头小，变黑软腐，茎基部软腐严重。

4级：植株死亡，根系腐烂，蒜头极小或者无蒜头

发病率=发病株数/调查总株数×100%.

×100.

2 结果与分析

2.1 病原菌的种类及分离频率

在大蒜的生长周期，分三个时期采集典型的根腐病蒜株。在患病大蒜的根际土壤样本中分离得到24株分离物，其中镰刀菌22株。在根腐病大蒜植株样本中，共分得分离物40株，其中镰刀菌39株，同时对比患病蒜株根际土壤中分离得到的真菌培养物(分离物24株，其中镰刀菌22株)，表明镰刀菌可能是造成吉木萨尔大蒜根腐病的主要病原菌。表1

2.2 镰刀菌种的鉴定

通过菌株在不同培养基上的培养性状、孢子及产孢结构形态大小等特征，参照真菌鉴定手册，参考Lester[12]和John等[13]关于镰刀菌的形态学描述，将61株镰刀菌鉴定为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、层生镰刀菌(Fusariumproliferatum)、芳香镰刀菌(Fusariumredolens)、三线镰刀菌(Fusariumtricinctum)、木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)和轮状镰刀菌(Fusariumverticillioides)。各个种所占的比例分别是：51.6%、25%、7.8%、6.2%、3.1%、1.6%。图1，图2，表1，表2

表1 大蒜根腐病病原物分离

Table 1 Isolates from the root rot diseaed garlic plants and rhizosphere soil samples

Isolates根际土 Rhizospheresoil病组织 Diseasedtissue分化期Differentiationstage抽薹期Bultingstage成熟期Maturestage分化期DifferentiationStage抽薹期Bultingstage成熟期Maturestage菌株数Numberofstrains分离频率Occurrencefrequency(%)尖孢镰刀菌F．oxysporum81510453351 6层生镰刀菌F．proliferatum410111625木贼镰刀菌F．equiseti1123 1芳香镰刀菌F．redolens2357 8轮状镰刀菌F．verticillioides111 6三线镰刀菌F．tricinctum12146 2葡萄溃疡病菌B．dothidea1白地霉G．candidum1毛霉M．circinelloides1

通过提取DNA，通用引物扩增ITS序列测序分析，序列长度在500 bp左右，与NCBI数据库进行比对，发现菌株YF2-1与层生镰刀菌F.proliferatumstrain H10序列一致性最高，为99%。菌株YF2-19与芳香镰刀菌F.redolensstrain E306序列一致性最高，达到99%。菌株YF2-4与尖孢镰刀菌F.oxysporumM102H序列同源性达到99%。菌株YF3-2 、YF4-2与尖孢镰刀菌F.oxysporumisolate Fol-km序列一致性较高，达到99%。图3

表2 典型菌株菌落及孢子形态

Table 2 Morphological characteristics of typical fungal isolates

菌株YF2-1StrainYF2-1菌株YF2-4StrainYF2-4菌株YF2-19StrainYF2-19菌株YF3-2StrainYF3-2菌株YF4-2StrainYF4-24d菌落直径(mm)Colonydiameterafter4days50×5535×3941×4730×3434×38菌落形态Colonymorphologies气生菌丝羊毛状，疏松。正面白色，反面紫色。分生孢子少。气生菌丝菌丝絮状，疏松。正面白色，背面白色。孢子粉状，大量。气生菌丝絮状，致密。正面白色，背面浅粉色。孢子粉状，大量。丁香花味。气生菌丝絮状，疏松。正面白色，背面浅粉色。孢子大量，粉状。气生菌丝絮状，致密。正面白色，背面棕黄色。孢子呈灰黄色，粉状，大量。大分生孢子Macroconidium长而直，两端略弯，舟形，3～5隔。细长，镰刀形，近安剖瓶形。有3～5隔。粗壮，纺锤形。多为3隔，偶有4隔。细长，镰刀形，少许弯曲，多数3隔细长，少许弯曲，镰刀形或新月形，3～5隔。小分生孢子Microconidium链生或假头生。卵形或棒槌形，无隔。假头生。纺锤形或者长椭圆形。0～1隔。假头生，单胞，棒槌形，偶有隔。假头生，卵形，单胞假头生，卵形，单胞瓶梗类型Phialides单瓶梗或“Z”形复瓶梗单瓶梗或“Z”形复瓶梗单瓶梗或“Z”形复瓶梗单瓶梗或“Z”形复瓶梗单瓶梗或“Z”形复瓶梗厚壁孢子Clamydospore无顶生或间生，球形。顶生或间生，球形。顶生或间生，球形。顶生或间生，球形。

注：A:菌落正面；B:菌落反面

Note：A: positive; B: back

图1 典型病原分离物在PDA平板上的菌落形态

Fig.1 Morphological characteristics of conidiospores and chlamydospores of typica fungal colonies isolated from root rot garlic plant tissues on PDA plate

注：A:YF2-1 B-C:YF2-4 D-E:YF2-19 F-G:YF3-2 H-I:YF4-2

Note：A:YF2-1 B-C:YF2-4 D-E:YF2-19 F-G:YF3-2 H-I:YF4-2

图2 典型病原分离物分生孢子与厚垣孢子的显微形态(放大倍数10×40)

Fig.2 The micromorphology of typical fungal isolates from the root rot diseased garlic on PDA plate (magnification10×40)

图3 基于ITS序列分析的菌株YF2-1、YF2-4、YF2-19、YF3-2、YF4-2的系统发育树状图

Fig.3 Phylogenetic tree of strain YF2-1、YF2-4、YF2-19、YF3-2、YF4-2 based on rDNA ITS sequence cluster analysis

2.3 病原菌的致病性测定

研究表明，大蒜根腐病在每年的5月底6月初开始出现，发病初期根部及茎基处表皮褐变软腐，严重时根系腐烂变黑。发病较轻的幼苗地上部分无明显症状，但随着生长和侵害的加重，患病植株长势逐渐变弱，地上部分发育不良，严重时蒜头极小，甚至整株萎蔫死亡。连作和自留种情况下发病更为严重。

对分离得到的菌株合并去重，选取典型的菌株进行回接实验。接种后植株的长势变弱，地上部分退黄萎蔫，茎基处接种点出现病斑，与田间自然发病的症状相似。通过对接种幼苗的再分离、培养形状和病原形态学观察，接种病原菌的发病幼苗均再次分离得到与接种菌一致的菌，证明回接选取的5株菌都是大蒜根腐病的病原菌。

盆栽幼苗接种病原菌30 d后，YF2-1、YF2-4、YF2-19处理组长势明显弱于接种PDA的CK组。接种后50 d，处理组YF2-1开始出现病死株。田间回接的病情调查结果表明，回接的5株菌都有一定的致病性，可以导致典型的大蒜植株茎基及根系褐变腐烂，其中尖孢镰刀菌致病性最强，其次为层生镰刀菌、芳香镰刀菌。图4，图5，表3

表3 大蒜根腐病病株分离物致病性测定

Table 3 Comparison of the pathogenicity ofFusariumspp.

接种病菌SpeciesofFusarium发病率Percentsofinfection(%)病情指数Diseaseindex层生镰刀菌YF2-1F．proliferatumYF2-17064 3尖孢镰刀菌YF2-4F．oxysporumYF2-49069 4芳香镰刀菌YF2-19F．redolensYF2-196066 7尖孢镰刀菌YF3-2F．oxysporumYF3-27050尖孢镰刀菌YF4-2F．oxysporumYF4-26070 8

3 讨 论

研究从新疆大蒜主产区的大蒜根腐病样品中分离得到镰刀菌61株，通过形态学和分子生物学鉴定为尖孢镰刀菌、层生镰刀菌、芳香镰刀菌、三线镰刀菌、轮状镰刀菌和木贼镰刀菌。从分离结果可以看出，患病植株的根际土壤中真菌的种类也趋向于单一化，主要以镰刀霉菌尤其是尖孢镰刀菌为主。病害样本组织中分离得到的优势菌是尖孢镰刀菌和层生镰刀菌。在分化期，虽然根腐病尚未集中爆发，地上部分多数还没呈现出典型的褪绿变黄、植株萎蔫状态，但此时植株幼苗尚小，对病菌的抵抗力也比较弱，比较容易受到侵染，因此，分得的病菌数量也较多。而幼苗时期即感病的植株，在后续的生长过程中会发生比较严重的根腐症状，多数植株在生长后期死亡，因此，幼苗期感染造成的危害也比较严重。通过调查发现连作方式和自留种都会加重病害的发生，这可能是由于连作障碍以及种子带菌导致的。

在大蒜的整个生长时期两类样本中都能够分得尖孢镰刀菌，这可能预示着尖孢镰刀菌是该病害的主要致病菌。研究选取了5株典型的病原分离物YF2-1、YF2-4、YF2-19、YF3-2、YF4-2进行原位伤根回接。YF2-1、YF2-4、YF2-19分离自分化期病样组织，YF3-2分离自抽薹期病样组织，YF4-2分离自成熟期病样组织。回接后盆栽和田间试验都表现出典型的根腐病症状，在发病植株组织中重新分得回接的菌株，表明这5株菌都有一定的致病性。因此，新疆大蒜的根腐病是由多种镰刀菌复合侵染造成的。实验选取的典型尖孢镰刀菌YF2-4、YF3-2、YF4-2不仅在各个生长期病样组织中都能分离得到，并且具有较高的侵染性，是吉木萨尔地区大蒜根腐病的优势致病菌。

镰刀霉菌是作物根腐病的主要致病菌。镰刀菌感染导致的根腐病在香蕉[14]、大豆[15、16]、三七[17]、掌叶大黄[18]、黄芪[19]、枸杞[20]、烟草[21]等多种作物上都有发生。根据报道，仅在新疆地区，就已经发生过镰刀菌引起的加工辣椒[22]、甜瓜[23、24]、红枣[25]、苜蓿[26]、花芸豆[27]、加工番茄[28]和大豆根腐病[16]。此次，也明确了发生在新疆大蒜作物上的根腐病致病菌是镰刀菌。

此外，在分离过程中出现镰刀菌属以外的毛霉等菌株，经分析并非致病菌，这可能有分离过程中病害组织表面土壤清理、消毒不彻底有关。分离过程中，发现部分病株上有蒜蛆出现，虫害的发生使植株完整程度受损，根系分泌物增多，抑制了土壤中有益菌群的繁殖，在一定程度上加重了病害的发生。根腐病是现阶段新疆大蒜种植中的主要病害之一。该病发病时间早，范围广，持续时间长，化学防治困难，直接影响大蒜的产量和品质。研究表明，大蒜根腐病是一种由多种病原菌引起的复杂的土传病害，因此，传统的田间防治缺乏针对性和有效性。在研究的基础上，引入病虫害生物防治为主的绿色、无公害的田间栽培管理技术，减少并控制病害的发生，实现“绿色植保”。

注：A：对照组 B-F:实验组YF2-1，YF2-4，YF2-19，YF3-2，YF4-2；H-I:典型症状

Note：A-C: experiment group YF2-1，YF2-4，YF2-19，YF3-2，YF4-2; D：control group H-I: typical field symptoms

图4 盆栽试验中病原菌回接后出现的典型的根腐病症状

Fig.4 The typical field symptoms of garlic root rot disease after the pathogen inoculation

in pot experiment

注：A-C:回接发病； D-F:自然发病

Note：A-C:artificial infection; D-F: natural infection

图5 病原菌回接后出现的典型的根腐病田间症状

Fig.5 The typical field symptoms of garlic root rot disease after the pathogen inoculation in field trial

4 结 论

新疆吉木萨尔地区大蒜根腐病正是由镰刀霉菌引起的一类土传病害。在分离得到的病原菌中选取典型的菌株回接，尖孢镰刀菌、层生镰刀菌和芳香镰刀菌都有一定致病性，其中尖孢镰刀菌在蒜的各个生长阶段的病害样本中都能分离得到，且分离频率最高，致病性也最强，是大蒜根腐病的优势致病菌，其次是层生镰刀菌。

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Supported by: Supported by Natural Science Foundation of Xinjiang "Isolation and identification of the pathogens causing garlic root rot in Xinjiang and the dynamic analysis of pathogenesis" (2014211B033)

Isolation and Identification of the Pathogens Causing Garlic Root Rot in Jimsar

ZHANG Li-juan, WANG Wei, XIE Yu-qing, ZHANG Zhi-dong, GU Mei-ying,ZHU Jing, TANG Qi-yong, WANG Bo, SONG Su-qin

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalScience/ .XinjiangLaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

【Objective】 In order to provide a scientific basis for the prevention and control of garlic root rot disease in Xinjiang, potential pathogens were isolated and identified from root garlic tissues. 【Method】Using conventional tissue separation method for the separation and purification of pathogenic bacteria of the strains were identified by traditional morphological identification method combined with molecular biological methods. The method of in situ root injury was used to control the species and pathogenicity of pathogenic bacteria by contrast with Koch's postulate. 【Result】64 isolates were purified from 3 batches root rot samples in Jimsar County, in which 61species were finally identified as theFusariumspp.F.oxysporum,F.proliferatum,F.tricinctum,F.redolens,F.verticillioides,F.equisetiwere involved in this disease.F.oxysporumandF.proliferatumcould be isolated from all growth stages with frequency of 76.6% in total. In situ pathogenicity tests demonstrated that 5 typical strains could cause the infection of root rot at different levels, and the major pathogen wasF.oxysporum, followed byF.proliferatum. 【Conclusion】Different species ofFusariumspp. are involved in garlic root rot in Xinjiang.F.oxysporumwas considered as the dominant pathogen because of its wide distribution, high frequency of isolation and strong pathogenicity.

garlic; root rot;Fusariumoxysporum; pathogenicity

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.018

2017-02-07

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目“新疆大蒜根腐病病原菌分离鉴定及发病规律动态分析”(2014211B033)

张丽娟(1986-)，女，山东德州人，助理研究员，硕士研究生，研究方向为微生物学，(E-mail)kindzhanglijuan@aliyun.com

S436.33

A

1001-4330(2017)04-0725-10