周登攀，郝小军，向本春

(石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区普通高校重点实验室，新疆石河子 832003)



新疆石河子地区设施樱桃病毒病害调查及病原检测

周登攀，郝小军，向本春

(石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区普通高校重点实验室，新疆石河子 832003)

【目的】研究新疆石河子地区设施樱桃病毒病的发生情况，明确病毒种类及带毒率。【方法】对新疆石河子设施樱桃病毒病害进行调查，利用已报道在樱桃上发生的8种病毒特异性引物，对122个设施樱桃疑似病毒病样品进行RT-PCR检测及序列同源性分析。【结果】石河子地区设施樱桃病毒病田间症状主要表现有花叶、卷叶、褪绿黄化、畸形、皱缩等。在样品中扩增出与樱桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、李属坏死环斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、李矮缩病毒(Prunedwarfvirus,PDV)和樱桃绿环斑驳病毒(Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)预期大小一致的目的片段；序列分析表明4种病毒扩增片段与GenBank中注册的相应病毒核苷酸和氨基酸序列均具有较高的同源性； 其中分离物CVA-SHZ、PNRSV-SHZ、PDV-SHZ和CGRMV-SHZ与GenBank中已报道的分离物ChTA12(KT310083.1)、DJ1-1(JF333586.1)、HSY4-1(HQ539657.1)、ZZ-Ch-13(KC965106.1)对核苷酸同源性分别为99.5%、99.5%、99.0%和99.4%。CVA、PNRSV、PDV和CGRMV的检出率分别为67.3%、61.1%、6.5%、4.9%，受两种及两种以上病毒复合侵染检出率56.5%。【结论】新疆石河子地区设施樱桃病毒病原以CVA和PNRSV为主，且两种病毒复合侵染较为普遍。这是在新疆设施樱桃上检测到CVA、PNRSV、PDV、CGRMV4种病毒。

设施樱桃；病毒；分子检测；复合侵染

0 引 言

【研究意义】随着新疆种植业结构调整和特色林果业的快速发展，樱桃在新疆各地区引种栽培面积逐年增加，目前在吐鲁番、哈密、阿克苏、喀什、乌鲁木齐、石河子、克拉玛依、伊犁等南北疆地区均有栽培[1]。随着樱桃栽培规模不断扩大，病毒病日益加重，已成为制约樱桃种植产业发展和樱桃产量及品质的主要因素[2]。建立快速有效的检测方法，对控制樱桃病毒病的传播和指导新疆各地区樱桃病毒病的防控提供科学依据。【前人研究进展】侵染樱桃的病毒达30多种，常见主要有20种[3,4]。我国已报道的侵染樱桃的病毒有12种，包括苹果花叶病毒(Applemosaicvirus，ApMV)、李属坏死环斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV、李矮缩病毒(Prunedwarfvirus,PDV)、苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)、樱桃锉叶病毒(Cherryraspleafvirus,CRLV)、樱桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、樱桃绿环斑驳病毒(Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)、李树皮坏死与茎痘伴随病毒(Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV)，樱桃小果病毒-2(Littlecherryvirus-2,LChV-2)、樱桃坏死锈状斑驳病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus,CNRMV)及樱桃小果病毒-1(Littlecherryvirus-1,LChV-1)[5-11]。1996 年，Zhou 等[5]首次报道我国甜樱桃病毒病的发生；同年李青等[12]利用ELISA法对北京地区的樱桃上PNRSV 的发生情况进行了检测；1998年，阮小凤等[13]对陕西樱桃上的病毒病也进行了检测；2009 年在云南也发现了甜樱桃病毒病的的报道[6]；2010至2015年，王文文、卢美光、刘聪利等[14-16]先后对辽宁、山东、北京以及河南等地的樱桃病毒病进行调查，发生较为普遍、检出率最高的樱桃病毒病主要为PNRSV、CVA以及PDV。【本研究切入点】新疆的设施樱桃种植面积不断扩大，而樱桃苗木多为内地引进，随着甜樱桃苗木引种和调运，新病毒病也有随着苗木传入新疆的潜在风险；加之栽培管理方式的及检疫措施的不完善等因素，樱桃病毒病害发生日趋严重。目前，关于新疆樱桃病毒病原的检测未见报道。针对新疆石河子地区周边团场设施樱桃病毒病进行研究。【拟解决的关键问题】研究观察设施樱桃病毒病田间症状并通过RT-PCR方法对设施樱桃发病情况进行检测，鉴定病原种类，调查复合侵染情况，为当地设施樱桃病毒病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2016年4～9月，以每株树作为1份样本，每株采集3～5片病叶，分别采集兵团第八师134团40份，136团25份，150团16份，葡萄研究所13份，141团11份和第七师129团18份，共采集樱桃叶片病样122份。分别装在不同的采集袋中，编号记录症状并拍照，实验室保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 引物合成

用于检测的8种病毒的相关引物设计参考国内外已报道文献和实验室设计。表1

表1 RT-PCR法扩增病毒基因组特异性片段的引物

Table 1 Primers for amplification segments of virus genomes by RT-PCR

引物名称Primers引物序列(5’→3’)Sequence(5’-3’)产物/ntProducts参考文献ReferencesCVA-FATGCTTCGCAGGTGACGATACVA-RGCTTGTTTGTGGAGGGAGAC652[17]PDV-FCGAAGTCTATTTCCGAGTGGPDV-RCCACTGGCTTGTTTCGCTGT304[17]CGRMV-FTGCGGGAAATCAACTCTTGTCCGRMV-RTGTGCCACCAAACACCTTAC363[15]PNRSV-FAACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAAPNRSV-RGCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC675[18]CRLV-FTGACTTTCCCAAGGATGAGACRLV-RGTGACATACCATAGATCC447[19]ACLSV-FTCTGCAAGAGAATTTCTGTTACLSV-RGTCTACAGGCTATTTATTATAAG800[15]CMV-FTATGATAAGAAGCTTGTTTCGCGCMV-RGCCGTAAGCTGGATGGACAA486本实验室CNRMV-FCTGACCCAGACTGGGAGGTCNRMV-RTTGGCGCACATGTCATCACC553[18]

1.2.2 主要试剂

RNA提取试剂购自Takara公司；反转录试剂盒购自Thermo公司； dNTPs、TaqPCR Mix 、琼脂糖凝胶回收试剂盒等，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；2 000 bp DNA Marker购自全式金生物；其他化学试剂均为国产分析纯级试剂。PCR引物由北京华大科技有限公司合成。大肠杆菌DH5α菌株为实验室保存。

1.2.3 植物组织总RNA的提取

植物组织总RNA提取步骤参照吴庆丰等[20]的方法。

1.2.4 RT-PCR反应

cDNA第一链的合成：以5 μL总RNA为模板，1 μL oligo(dT)18为引物，1 μL随机六聚体引物，6 μL无核酸酶的高纯水轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5 min，冰上冷却2 min，离心后加4 μL 的5×第一链反应缓冲液，1 μL RiboLockTM RNA酶抑制剂，2 μL 10 mM dNTPs Mix，Revert AidTM M-MnLV逆转录酶，轻轻混匀，离心，42℃孵育60 min，70℃加热5 min终止反应，-60℃保存备用。

PCR反应：以合成的cDNA第一链为模板进行PCR。25 μL反应体系：cDNA 3 μL，上游引物(10 μM)1 μL，下游引物(10 μM)1 μL，TaqPCR Mix 12.5 μL，加ddH2O至终体积为25 μL。PCR扩增条件为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火30 s，温度根据引物设定；72℃延伸50 s，35个循环；后72℃延伸10 min，4℃保存。反应结束后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相。

1.2.5 序列测定及其分析

琼脂糖凝胶回收目的片段，回收产物连接至pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5α菌株后，进行蓝白斑筛选，通过菌落PCR以及酶切验证的阳性克隆，送至北京华大基因生物公司进行测序。利用GenBank 数据库中的BLAST 程序对测序结果进行同源性检索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通过DNAStar、MEGA version 5.0 软件进行相似序列比较分析， 采用邻接法(Neighbor Joining)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 设施樱桃田间发病症状

研究表明，兵团第八师134团、136团、150团、141团、葡萄研究所和第七师129团的设施樱桃病毒病害症状表现复杂多样。且在4至9月，田间症状主要表现为花叶、褪绿、皱缩、卷叶、畸形。这些典型症状往往相互伴随其他症状。由于有些病毒侵染植物后不表现症状，为潜隐性危害，必须通过采样进行病毒检测来进一步明确樱桃病毒病的发生情况。图1

A、E：斑驳花叶；B、F：皱缩；C、G：褪绿；D、H：畸形

A.E: Patches Mosaic; B,F: Crinkle; C,G: chlorsis; D,H: deformity

图1 设施樱桃病毒病症

Fig.1 Symptoms of virus diseases on facilities cherry

2.2 设施樱桃病毒种类分子检测

2.2.1 设施樱桃 RT-PCR检测病毒种类

提取叶片总RNA，以随机六聚体引物反转录的cDNA第一链为模板，选取各病毒的特异性检测引物进行RT-PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，8种甜樱桃待检病毒中，只有4种病毒检测结果呈阳性，分别为用CVA特异性引物扩增出650 bp左右的条带(图2b)，PNRSV特异性引物扩增到约670 bp的条带(图2a)，PDV特异性引物扩增出300 bp左右的条带(图2c)，CGRMV特异性引物扩增到约360 bp的条带(图2d)。每种病毒特异性引物扩增获得的片段大小均与预期结果相同。用其它病毒检测引物扩增均未获得与预期片段大小相符的条带。

为进一步验证RT-PCR检测结果的可靠性，分别对CVA、PNRSV、PDV、CGRMV检测引物扩增产物进行纯化、克隆和测序，并与GenBank中注册的相关病毒的核苷酸序列进行对比，结果表明，4个片段长度分别为652 bp、675 bp、304 bp、363 bp，分别与数据库中CVA、PNRSV、PDV、CGRMV 4种病毒上的部分基因具有高度的同源性。因此，确定检测结果为上述4种病毒并将这4个分离物分别鉴定为CVA-SHZ、PNRSV-SHZ、PDV-SHZ、CGRMV-SHZ。图2

a.M:DNA Marker(2 000 bp); 1:阴性对照; 2: PNRSV病样.b. M:DNA Marker(2 000 bp); 1:阴性对照; 2: CVA病样.c. M:DNA Marker(2 000 bp); 1:阴性对照; 2:为PDV病样.d. M:DNA Marker(2 000 bp); 1:阴性对照; 2:为CGRM病样.

a. M: DNA Marker (2,000 bp); 1:Negative control;2: infected of PNRSV sample. b. M: DNA Marker (2,000 bp); 1: Negative control; 2: infected of CVA sample. c. M: DNA Marker (2,000 bp); 1: Negative control;2: infected of PDV sample. d. M: DNA Marker (2,000 bp); 1:Negative control;2: infected of CGRMV sample

图2 新疆石河子地区部分设施樱桃病毒病原的RT-PCR扩增结果

Fig.2 RT-PCR amplification result of some facilities cherry virus disease in Shihezi, Xinjiang Province

2.2.2 樱桃病毒CVA-SHZ分离物与其他分离物同源性

将CVA-SHZ分离物与基因库中序列比对，核苷酸序列与已报道的CVA分离物序列核苷酸序列同源性在75%～99%。其中与中国山东的ChTA12(KT310083.1)和ChTA11(KT285841.1)分离物核苷酸同源性最高为99.5%；与捷克得到的Rannaja46(KU215411.1)分离物核苷酸同源性最低为75.7%。表2

表2 CVA-SHZ与其它CVA分离物同源性比较

Table 2 Homologous comparion of nucleotide sequences of between CVA-SHZ and other CVA isolates

分离物Isolates登录号GenbankAccessionNo．寄主Host国家Nation同源性 Homology核苷酸 Nucleotide(%)JLC125634．1PrunuarmeniacaJapan81 7JKFN691959．1PrunsaviumIndia76 3PFHQ267856．1PrunusdomesticaFrance81 3Rannaja46KU215411．1SourcherryCzechRepublic75 7Lambert43KU215410．1CherryCzechRepublic76 2TaianKU131205．1SweetcherrtChina98 6ChTA12KT310083．1PrunusaviumChina99 5ChTA11KT285841．1PrunusaviumChina99 5WKLN879388．1TreeAustralia81 6CVANC003689．1SweetcherryUSA97 7FRGX82547．1SweetcherryFRG97 7

将CVA-SHZ与CVA其他分离物核苷酸序列构建系统发育树，研究表明，CVA-SHZ分离物与中国在甜樱桃上得到的ChTA12(KT310083.1)和ChTA11(KT285841.1)两个分离物进化树关系最近，在同一个进化分支中。图3

图3 基于CVApolyprotein基因部分核苷酸序列构建的系统进化树

Fig.3 Phylogenetic tree based onpolyproteingene partial nucleotide sequences of CVA

2.2.3 设施樱桃病毒PNRSV-SHZ分离物CP基因与其他分离物同源性

将PNRSV-SHZ分离物与基因库中序列比对，核苷酸序列与已报道的PNRSV分离物序列核苷酸同源性在91%～99%，氨基酸序列同源性在91%～99%。其中与中国DJ1-1(JF333586.1)分离物核苷酸同源性最高为99.5%，氨基酸同源性为99.3%；与中国在巴旦木上得到的XJC-39(JQ247431.1)分离物核苷酸同源性最低为91.5%，氨基酸同源性为91.4%。表3

用MEGA5.2软件将樱桃分离物PNRSV-SHZ与PNRSV其他分离物cp核苷酸序列构建系统发育树。研究表明，PNRSV-SHZ与其他PNRSV分离物构建的发育树共形成两大分支，其中PNRSV-SHZ与中国在樱桃上得到的DJ1-1(JF333586.1)、Beijing (DQ300178.1)、Chr-p(HQ833191.1)分离物，中国在桃子上得到的PchGCS5(KF135196.1)分离物、中国在杏子上得到的AprSX3(KF135204.1)分离物、匈牙利得到的PNRSV-Mk(EU368738.1)、智利在樱桃李上得到的PlmCl.mrb1(EF565260.1)分离物、捷克斯洛伐克在李子上的得到的GG(AY037788.1)、意大利在巴旦木上得到的AlmIt.cor1(AJ133204.1)分离物在一个进化分支中；但与中国在樱桃上得到的DJ1-1(JF333586.1)分离进化关系最近。中国在巴旦木上的到的XJC-12(JQ247429.1)、XJC-47(JQ247432.1)、XJC-35(JQ247430.1)、XJC-39(JQ247431.1)分离物形成另一分支。图4

表3 PNRSV-SHZ与其它PNRSV分离物核苷酸序列同源性比较

Table 3 Homologous comparison of nucleotide sequences of between PNRSV-SHZ and other PNRSV isolates

分离物Isolates登录号GenbankAccessionNo．寄主Host国家Nation同源性 Homology(%)核苷酸 Nucleotide氨基酸 AminoDJ1-1JF333586 1RedLampChina99 599 3BeijingDQ300178 1cherryChina99 099 3PlmCl．mrb1EF565260 1MirabolanChile98 597 8Chr-pHQ833191 1cherryChina97 797 1PNRSV-MkEU368738 1PrunusaviumHungary98 598 6PchGCS5KF135196 1peachChina97 297 1AprSX3KF135204 1apricotChina98 298 6GGAY037788 1plumSlovakia97 798 6XJC-12JQ247429 1AlmondChina93 093 5XJC-47JQ247432 1AlmondChina93 291 4XJC-35JQ247430 1AlmondChina92 791 4XJC-39JQ247431 1AlmondChina91 591 4AlmIt．cor1AJ133204 1AlmondItaly98 097 8

图4 基于PNRSVCP基因核酸序列构建的系统进化树

Fig.4 Phylogenetic tree based onCPgene nucleotide sequences of PNRSV

2.2.4 设施樱桃病毒PDV-SHZ分离物和CGRMV-SHZ分离物与其他分离物同源性

将PDV-SHZ分离物与基因库中序列比对，核苷酸序列与已报道的PDV分离物序列核苷酸同源性在90.5%～99.0%。其中与中国分离物HSY4-1(KC965106.1)核苷酸同源性最高为99.0%，与捷克分离物Rannaja 46(KU215404.1)、葡萄牙分离物(AF202117.1)和分离物(AY646848.1)核苷酸同源性最低为90.5%。CGRMV-SHZ分离物与基因库中序列比对结果显示，核苷酸序列与已报道的CGRMV分离物序列核苷酸同源性在91.9%～99.4%，其中与中国分离物ZZ-Ch-13(HQ539657.1)核苷酸同源性最高为99.4%，与中国分离物Pe-wh-42(KR820543)核苷酸同源性最低为91.9%。

2.3 石河子地区设施樱桃樱桃病毒病检出率

通过设计特异性引物对6个基地采集的122份设施樱桃疑似病样进行RT-PCR检测，兵团第八师134团、136团、150团、141团、葡萄研究所和第七师129团设施樱桃病毒的总检出率分别为85.0%、76.0%、81.2%、90.9%、77.8%、83.3%。主要有2种病毒，为CVA和PNRSV，这2种病毒的总检出率分别为67.3%和61.1%，两种病毒复合侵染检出率为36.1%。134团设施樱桃检测中PNRSV在4种病毒中检出率较高，其他采集地CVA检出率较高;只有129团和葡萄研究所检测到PDV，检出率分别为27.8%和23.0%；葡萄研究所检测出CGRMV，检出率为46.1%。说明石河子地区侵染设施樱桃的病毒以樱桃病毒A(CVA)和李属坏死环斑病毒(PNRSV)为主，不同地点病毒检出率不同并且相同地点的不同病毒检出率也有差异。表4，表5

表4 各地不同品种病原病毒的检出率

Table 4 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions and varieties

样品采集地Location样品数(份)Numberofsamples各地病毒总检出Totaldetectionratesofvirusesindifferentregions(%)各病毒检出率Detectionrateofvariousviruses(%)CVAPNRSVPDVCGRMV134团 134Tuan4085 050 075 000136团 136Tuan2576 032 044 000150团 150Tuan1668 462 556 200129团 129Tuan1877 861 138 927 80葡萄研究所GrapeResearchInstitute1383 375 050 023 046 1141团 141Tuan1090 972 854 600总计 Intotal12281 967 361 16 54 9

表5 各病原病毒的复合侵染率

Table 5 Complex infection rates of various pathogenic viruses

样品采集地Location复合侵染率 Complexinfectionrates(%)PNRSV+PDVPNRSV+CGRMVCVA+PNRSVCVA+PDVCVA+PDV+CGRMVCVA+PNRSV+PDVCVA+PDV+PNRSV+CGRMV134团 134Tuan0032 00000136团 136Tuan0040 00000150团 150Tuan0031 60000129团 129Tuan27 7022 316 6011 10葡萄研究所GrapeResearchInstitute23 046 138 415 430 115 47 6141团 141Tuan0036 30000总计 Intotal6 54 936 14 13 33 20 8

3 讨 论

研究针对兵团第八师和第七师6个采集地设施樱桃病毒病进行田间调查，樱桃叶片多表现皱缩、花叶、褪绿斑驳、细长畸形、黄化等症状，与文献报道基本一致[15]。通过对新疆第134团、136团、150团、141团、葡萄研究所和第七师129团122份设施樱桃疑似病样进行了RT-PCR分子检测，可能由于采集样品范围较小，研究主要检测出CVA、PNRSV、PDV、CGRMV4种病毒，兵团第八师134团、136团、150团、141团、葡萄研究所和第七师129团采集样本的带毒率分别为85.0%、76.0%、81.2%、90.9%、77.8%、83.3%，根据结果初步判定侵染并危害石河子地区设施樱桃的病毒有CVA、PNRSV、PDV、CGRMV，其中多以复合侵染，CVA和PNRSV两种病毒的复合侵染率为36.1%，随着病毒种类增多，复合侵染率降低。因此，新疆石河子地区设施樱桃病毒病的发生将成为影响该地区樱桃品质和产量的一个潜在因素。由于采集地范围所限，除此4种病毒外，是否还存在其他未知樱桃病毒，有待进一步深入的研究。

通过对4个分离物序列分析，CVA-SHZ分离物核苷酸序列与中国山东泰安的分离物ChTA12(KT310083.1)和ChTA11(KT285841.1)同源性高达99.5%。PDV-SHZ分离物核苷酸序列与中国分离物HSY4-1(KC965106.1)氨基酸同源性最高为99.0%，CGRMV-SHZ分离物核苷酸序列与中国分离物ZZ-Ch-13(HQ539657.1)核苷酸同源性最高为99.4%。石河子分离物PNRSV-SHZ CP基因核苷酸序列与中国山东樱桃上PNRSV分离物DJ1-1(JF333586.1)的同源性最高为99.5%，而与新疆果树巴旦木上四个分离物XJC-12(JQ247429.1)、XJC-47(JQ247432.1)、XJC-35(JQ247430.1)和XJC-39(JQ247431.1)序列同源性最低为93.0%、93.2%、92.7%和91.5%，从系统进化树分析也与山东DJ1-1关系最近而与新疆分离物关系最远。石河子地区樱桃种苗主要来自源于山东和辽宁[21]。推测新疆石河子地区樱桃上的PNRSV病原并非该地区其他带毒果树上感染的病原，可能与石河子地区樱桃引种来源有关。CVA和PNRSV都属于检疫性病毒，具有一定的检疫重要性[22]，因此，加强对苗木引种和调运病毒检疫检验工作，是控制该地区樱桃病毒病发生的主要途径。

4 结 论

通过对新疆石河子设施樱桃病毒病害进行调查以及利用特异性引物对122个设施樱桃疑似病毒病样品进行RT-PCR检测及序列同源性分析。石河子地区设施樱桃病毒病田间症状主要表现有花叶、卷叶、褪绿黄化、畸形、皱缩等，通过RT-PCR检测出的病毒有CVA、PNRSV、PDV和CGRMV；其中分离物CVA-SHZ、PNRSV-SHZ、PDV-SHZ和CGRMV-SHZ序列分析与GenBank中注册的相应病毒核苷酸序列同源性最高均高于99%。其检出率依次为67.3%、61.1%、6.5%、4.9%，两种及两种以上病毒复合侵染检出率56.5%。说明新疆石河子地区设施樱桃病毒病原以CVA和PNRSV为主，且两种病毒复合侵染较为普遍。

References)

[1] 张春山, 赵英, 张开春,等. 基于灰色聚类的新疆甜樱桃栽培气候区划探析[J]. 北方园艺, 2012,(9):32-34.

Zhang Chun-shan, ZHAO Ying, ZHANG Kai-chun, et al. (2012). Analysis of the grown climatic zoning of sweet cherry in Xinjiang based on grey clustering [J].NorthernHorticulture, (9):32-34. (in Chinese)

[2]董薇, 宋雅坤, 吴明勤,等. 大樱桃病毒病研究进展[J]. 中国农学通报, 2005, 21(5):332-336.

DONG Wei, SONG Ya-kun, WU Ming-qin, et al. (2005).Advances in research of cherry virus diseases [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 21(5):332-336. (in Chinese)

[3]王文文, 宗晓娟, 陈立伟,等. 中国甜樱桃病毒病及其检测技术研究进展[J]. 湖北农业科学, 2012, 51(18):3 929-3 933.

WANG Wen-wen, ZONG Xiao-juan, CHEN Li-wei, et al. (2012).Advances in sweet cherry viruses and detection technology in China [J].HubeiAgriculturalSciences, 51(18):3,929-2,933. (in Chinese)

[4]Isogai, M., Aoyagi, J., Nakagawa, M., Kubodera, Y., Satoh, K., & Katoh, T., et al. (2004). Molecular detection of five cherry viruses from sweet cherry trees in japan.JournalofGeneralPlantPathology, 70(5):288-291.

[5]Zhou, Y. Y. (1996). First report of sweet cherry viruses in china.PlantDisease, 8(12):1,429.

[6]Rao, W. L., Zhang, Z. K., & Li, R. (2009). First report of cherry virus a in sweet cherry trees in china.PlantDisease, 93(4):425.

[7]Tan, H. D., Li, S. Y., Du, X. F., & Seno, M. (2010). First report of cucumber mosaic virus in sweet cherry in the people's republic of china.PlantDisease, 94(11):1,378.

[8]Zhou, J. F., Wang, G. P., Kuang, R. F., Wang, L. P., & Hong, N. (2011). First report of cherry green ring mottle virus on cherry and peach grown in china.PlantDisease, 95(10):1,319.

[9]Zhou, J. F., Wang, G. P., Qu, L. N., Deng, C. L., Wang, Y., & Wang, L. P., et al. (2013). First report of cherry necrotic rusty mottle virus on stone fruit trees in china.PlantDisease, 97(2):290.

[10]Lu, M. G., Gao, R., Chen, R. R., Wu, B., Zhang, Z. X., & Li, S. F. (2015). First report of little cherry virus 1 in sweet cherry trees in china.PlantDisease, 99(8):1,191.

[11]陈君帜, 李青. 李属植物脱毒技术及病毒检测研究进展[J].北京林业大学学报, 2001,23(5): 71-74.

CHEN Jun-zhi, LI Qing. (2001). Advances of research on eradication and detection of viruses in Prunus species.[J].JournalofBeijingForestryUniversity, 23(5): 71-74. (in Chinese)

[12]阮小凤,杨勇,马书尚,等.甜樱桃病毒病的ELISA检测研究[J].山东农业大学学报(自然科学版)，1998,29(3):277-282.

RUAN Xiao-feng, YANG Yong, MA Shu-shang, et al. (1998). Research on virus detection by ELISA in sweet cherry [J].JournalofShandongAgriculturalUniversity, 29(3):277-282. (in Chinese)

[13]王文文,宗晓娟,王甲威,等. 环渤海湾地区甜樱桃小果病毒及樱桃病毒A的鉴定与调查[J].植物保护,2013,39(2):128-133.

WANG Wen-wen, ZONG Xiao-juan, WANG Jia-wei, et al. (2013). Identification and investigation ofLittlecherryvirusandCherryvirusAon sweet cherry around Bohai bay [J].PlantProtection, 39(2):128-133. (in Chinese)

[14]卢美光, 吴冰, 高蕊,等. 我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测[J]. 植物保护, 2015, 41(1):98-103.

LU Mei-guang, WU Bing, GAO Rui, et al. (2015). Preliminary investigation on cherry virus diseases and detection of the pathogens in some regions of China [J].PlantProtection,41(1):98-103. (in Chinese)

[15]刘聪利，李明，赵改荣，等. 河南甜樱桃病毒病害调查及病原检测[J].植物保护，2016,42(4)：200-204.

LIU Cong-li, LI Ming, ZHAO Gai-rong, et al. (1016).Investigation and pathogen detection of sweet cherry virus disease in Henan [J].PlantProtection, 42(4):200-204. (in Chinese)

[16]宗晓娟, 王文文, 王甲威,等. SYBR Green I实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用[J]. 植物保护学报, 2012, 39(6):497-502.

ZONG Xiao-juan, WANG Wen-wen, WANG Jia-wei, et al. (2012). The application of SYBR GreenⅠreal-time quantitative RT-PCR in quantitative analysis of sweet cherry viruses in different tissues[J].ActaPhytophylacicaSinica, 39(6):497-502. (in Chinese)

[17]Noorani, M. S., Awasthi, P., Sharma, M. P., Ram, R., Zaidi, A. A., & Hallan, V. (2013). Simultaneous detection and identification of four cherry viruses by two step multiplex rt-pcr with an internal control of plant nad5 mrna.JournalofVirologicalMethods, 193(1):103-110.

[18]James, D., & Upton, C. (2005). Genome segment rna-1 of a flat apple isolate of cherry rasp leaf virus: nucleotide sequence analysis and rt-pcr detection.ArchivesofVirology, 150(7):1,469-1,476.

[19]吴庆丰, 牛建新, 李文慧,等. 梨树苹果茎痘病毒PRINS检测中引物的设计及退火温度的测定[J]. 新疆农业科学, 2011, 48(11):2 067-2 070.

WU Qing-feng, NIU Jian-xin, LI Wen-hui, et al. (2011). Q F, Niu J X, Li W H, et al. The Design of the Primer and the Testing of Annealing Temperature of ASPV PRINS Detection [J].XinjiangAgriculturalSciences, 48(11):2,067-2,070. (in Chinese)

[20]孙桂香, 李宏业, 鲍酱健,等. 石河子大樱桃的引种与种植技术[J]. 新疆农垦科技, 2012,(11):17-18.

SONG Gui-xiang, LI Hong-ye, BAO Jiang-jian, et al. (2012). Introduction and planting techniques of Shihezi cherry [J].XinjiangFarmlandReclamationScience&Technology, (11):17-18. (in Chinese)

[21]殷智婷, 韩剑, 周国辉,等. 李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析[J]. 果树学报, 2012,(5):740-746.

YIN Zhi-ting, HAN Jian, ZHOU Guo-hui, et al. (2012). Cloning and sequence analysis of CP gene ofPrunusnecroticringspotvirusfrom almond plants in Xinjiang [J].JournalofFruitScience, (5):740-746. (in Chinese)

Investigation and Pathogen Detection of Cherry Virus Disease in Greenhouses in Shihezi of Xinjiang

ZHOU Deng-pan, HAO Xiao-jun, XIANG Ben-chun

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

【Objective】 In order to investigate the situation and identify the virus types of cherry virus diseases in greenhouse cultivation cherry in Shihezi of Xijiang. 【Method】Virus diseases were investigated in greenhouse cultivation cherry in Shihezi, eight pairs of specific primers were utilized to detect the 122 symptomatic samples by RT-PCR. 【Result】The results show that symptoms mainly included mosaic and green mottle, roll leaf, yellow, deformity, crinkle, etc. RT-PCR amplification showed that Cherry virus (CVA),Prunusnecroticringspotvirus(PNRSV),Prunedwarfvirus(PDV),Cherrygreenringmottlevirus(CGRMV) were found in the samples; The similarity analysis of the nucleotide sequences showed that isolates of CVA-SHZ, PNRSV-SHZ, PDV-SHZ and CGRMV-SHZ were reported in GenBank isolates ChTA12(KT310083.1), DJ1-1(JF333586.1), HSY4-1(HQ539657.1), ZZ-Ch-13(KC965106.1). And their nucleotide homologies were 99.5%, 99.5%, 99.0% and 99.4%，respectively. The average rates of infection with CVA, PNRSV, PDV and CGRMV were 67.3% , 66.1%, 6.5% and 4.9%, respectively. The average rates of infection with more than two viruses were 56.5% samples. 【Conclusion】CVA and PNRSV are the main viruses in greenhouse cherry in Shihezi of Xijiang, and the mixed infection of the two are common. This is the first report on the detection of CVA, PNRSV, PDV and CGRMV in cherry in Xinjiang.

greenhouse cherry; virus disease; molecular detection; mixed infection

XIANG Ben-chun(1958-), male, Yibin in sichuan province，professor，Doctoral tutor，The research direction for plant viruses and diseases. (E-mail)Xiang@shzu.edu.cn

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.017

2017-01-16

兵团农作物病害安全防控创新团队(0205-KC0017)

周登攀(1990- )，男，河南商丘人，硕士研究生，研究方向为植物病毒及其病害，(E-mail)593345795@qq.com

向本春(1958-)，男，四川宜汉人，教授，博士生导师，研究方向为植物病毒及其病害，(E-mail)XBC@shzu.edu.cn

S436.629

A

1001-4330(2017)04-0715-10

Supported by: Supported by Crop Disease Prevention and Control Innovation Team Program of XPCC (0205-KC0017)