韩宏伟，廖晴，玛尔哈巴·吾斯满，王浩，庄红梅，王强，沙红

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091)



德国鸢尾组培快繁过程中内生菌的分离、鉴定及控制药剂筛选

韩宏伟，廖晴，玛尔哈巴·吾斯满，王浩，庄红梅，王强，沙红

(新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091)

【目的】在德国鸢尾的组培过程中，内生菌引起的污染制约着其进行快速繁殖工厂化育苗，针对引起德国鸢尾组培苗污染的内生菌进行分离、鉴定，研究比较6种常用药剂对该菌株的抑制效果，筛选出最佳防治药剂，为德国鸢尾组培快繁过程中有效控制内生菌污染提供科学依据。【方法】采用NA培养基分离纯化菌株(115325)，通过形态特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析，对其进行分类鉴定。采用纸碟抑菌圈法测定6种常用药剂对供试菌株的抑制效果。【结果】供试菌株115325的形态特征，及生理生化指标与表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)基本相同。16S rDNA序列分析表明，该菌株与解糖葡萄球菌S.saccharolyticus(L37602) 进化关系最为密切，聚在同一个系统发育分支，与表皮葡萄球菌的同源性最高，为99.86%。室内药剂筛选结果表明，头孢菌素和庆大霉素对供试菌株的抑制作用最强。【结论】综合形态学特征、生理生化特性及 16S rDNA 序列分析结果，供试菌株115325被鉴定为表皮葡萄球菌。头孢菌素和庆大霉素可作为抑制德国鸢尾组培苗内生菌污染的首选药剂。

德国鸢尾；内生菌；组织培养；鉴定；控制药剂

0 引 言

【研究意义】德国鸢尾是一种多年生宿根花卉，其花色艳丽而丰富，花姿奇特，且适应性强，是园林绿化、美化，花坛、草坪装饰的优良材料。我国德国鸢尾种苗多从国外引进，数量少，有很多品种不能形成种子，分株繁殖率较低，通过组织培养快速繁殖是尽快满足应用需求的最为有效的途径[1]。在德国鸢尾组培快繁过程中发现，经过多代培养后，苗丛基部慢慢会出现细菌感染，呈现鼻涕状菌落，并向外蔓延，甚至有些会扩展到组培苗嫩叶上，后期逐渐褐化枯萎死亡，严重影响德国鸢尾组培苗的快繁生产。研究通过分离、鉴定引起德国鸢尾组培苗污染的内生菌，筛选出控制该病原菌的最有效药剂，为有效控制德国鸢尾组培快繁过程中内生菌的污染提供技术保障。【前人研究进展】 植物内生菌(Endophyte)是指存活于健康植物组织内部，而又不引发宿主植物表现出明显感染症状的微生物类群，主要包括真菌、细菌和放线菌[2]。关于植物组织培养过程中内生菌的污染已有很多报道，如金线莲(Anoectochilusroxburghii)组培中内生菌污染率达到 50%[3]，仙客来(Cyclamenpersicum)的块茎组织内生细菌污染率达83.0%[4]，地黄(Rehmanniaglutinosa)由于有内生细菌的存在污染率达 100%等[5]。从已有的报道看，被鉴定的内生菌种类主要有：黄单胞菌属(Xanthomonas)[6]、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)[7]、假单胞属(Pseudomonas)[8]、 土壤杆菌属(Agrobacterium)[9]、葡肠杆菌属(Enterobacter)、棒杆状菌属 (Corynebacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)、短小杆菌属(Curtobacterium)[10]、欧文氏菌属(Erwinia)[11]等。【本研究切入点】有关德国鸢尾组织培养过程中内生菌污染的问题，未见相关文献报道。研究通过对德国鸢尾组培快繁过程中的内生菌进行分离与鉴定，比较几种食品添加剂和抗生素对该内生菌株的抑制效果，筛选出抑制效果最好的药剂，为德国鸢尾组培快繁过程中有效控制内生菌污染提供科学依据。【拟解决的关键问题】研究分离鉴定出在德国鸢尾组培快繁过程中的内生菌种类，筛选出最有效的控制药剂，为有效控制德国鸢尾进行快速繁殖工厂化育苗中内生菌污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试材料

供试材料为引进的德国鸢尾受内生菌污染的组培苗。

1.1.2 培养基及试剂

用NA培养基分离和培养供试内生菌株，用LB培养基摇培，蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂粉、酵母粉等配制培养基所用试剂均为国产分析纯。细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司，细菌16S rDNA通用引物 (27F/1492R) 、2×TaqPCR MasterMix等试剂购自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 内生菌的分离纯化及控制药剂筛选1.2.1.1 内生菌分离纯化

挑取受污染的德国鸢尾组培苗培养基上的菌苔，划线接种到NA培养基上，挑取单菌落连续纯化3代后，接种到液体LB培养基中，37℃恒温，200 r/min摇培6 h，用于基因组DNA提取及拮抗药剂筛选。

1.2.1.2 控制药剂筛选

采用纸碟抑菌圈法测定供试药剂的抑菌效果。将摇培过夜的供试内生菌菌悬液以1%的体积比加入冷却至40～50℃的加琼脂粉的NA培养基中，迅速摇匀后倒平板；用打孔器将滤纸打成直径大小一致的纸片，分别浸入到配好的不同浓度的供试药剂中，充分浸湿以后贴入到已倒好的含菌培养基平板上，4℃恒温扩散5 h，37℃恒温静置培养24 h，测量抑菌圈的直径，每个处理设3次重复。

1.2.2 形态特征、生理生化指标测定

光学显微镜下观察供试菌株个体形态特征，并通过测定供试菌株D-葡萄糖产酸、麦芽糖产酸、L-阿拉伯糖产酸等糖发酵试验、还原硝酸盐、水解淀粉、温度生长适应性、pH适应性及对氯化钠的耐受性等生理生化指标,以《常见细菌鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]为依据对供试菌株进行鉴定。

1.2.3 16S rDNA序列分析

细菌基因组DNA提取用天根TIANamp Bacteria DNA Kit(离心柱型)，方法参考说明书。16S rDNA-PCR反应体系(25 μL)：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，模板1.0 μL(20 ng左右)，引物27F/1492 R (10 μmol/L)各1.0 μL，用灭菌双蒸水补足至25 μL。正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；反向引物1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′[13]。扩增条件:95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 共30个循环；72℃延伸10 min； 4℃ 保存。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，挑选清晰且大小合适的条带进行回收，连接转化后送生工生物(上海)股份有限公司测序。转化载体为pEASY®-T5 Zero Cloning Vector,反应条件参考pEASY®-T5 Zero Cloning Kit说明书。

将测序得到的16S rDNA全序列在网上(http://www.ezbiocloud.net/identify)进行同源性搜索，用MEGA 5软件构建系统发育树，确定该菌株的系统发育地位。

2 结果与分析

2.1 形态特征观察及生理生化试验

研究表明，供试菌株115325(图1b)在NA培养基上表现为乳白色不透明菌落，有凸起，表面光滑，边缘整齐；菌体革兰氏染色为阳性，多球形或稍椭圆形，直径0.5～1.5 um，排列成葡萄串状，无鞭毛，不能运动，无芽孢。图1

a:供试菌株污染的德国鸢尾组培苗；b:供试菌株在NA培养基上的菌落形态

a:Irisgermaica’s cultivation seedling polluted by the strains tested; b: Colony morphologies of the strain 115325 on NA culture medium

图1 供试菌株的形态学特征

Fig.1 The strains morphology charateristics

生理生化特征测定结果表明，与《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]及《常见细菌鉴定手册》中描述的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)基本相同，可被鉴定为表皮葡萄球菌。表1

表1 菌株115325部分生理生化指标测定

Table 1 The strains(115325)of physiological and biochemical index determination

测定项目Determinationproject结果Results测定项目Determinationproject结果ResultsD-葡萄糖产酸D-dextrose+Maltose+蔗糖产酸Canesugar+NaCl耐受性NaClgrowth2%+7%+10%+L-阿拉伯糖产酸L-Arabiacandy-淀粉水解Starchhydrolysis-pH值pHvalue5 0营养肉汤5．0nutrientbroth+8 2营养肉汤8．2nutrientbroth+利用乳糖Lactose-山梨醇产酸Sorbitol-还原硝酸盐Nitratereduction+木糖产酸Xylose-甘露醇厌氧产酸Mannitolanaerobic-棉子糖产酸Raffinose-利用蛋白胨Peptone+A蛋白Aprotein-利用牛肉浸膏Beefextract+甘油Glycerinum+核糖醇Ribitol+

注：+：阳性反应；-：阴性反应

Note：+: Positive reaction; -: Negative reaction

2.2 16S rDNA序列分析

以供试菌株115325的基因组DNA为模板，用16S rDNA通用引物(27F/1492R)PCR扩增，得到了大小1.5 Kb左右的片段(图2c)，回收纯化后(图2d)，连接转化到pEASY®-T5 Zero Cloning Vector上，PCR鉴定阳性克隆(图2e)。图2

c: 供试菌株16S rDNA扩增结果；d:回收产物；e:阳性克隆鉴定

c: 16S rDNA PCR;d:recycled product;e:positive cloning identification

图2 供试菌株16S rDNA纯化

Fig.2 The strains of 16S rDNA purification

16S rDNA序列同源性比较分析参考刘绍雄[14]等的方法，将测序所得序列拼接后输入网站(http://www.ezbiocloud.net/identify)进行同源性搜索，获取与供试菌株16S rDNA序列同源性较高的部分菌株序列，构建系统发育树，供试菌株115325与解糖葡萄球菌S.saccharolyticus(L37602)聚在同一个系统发育分支，进化关系最为密切。同源性比对结果表明，供试菌株16S rDNA序列与表皮葡萄球菌S.epidermidis(L37605)同源性最高，达99.86%，与S.saccharolyticus(L37602)的同源性为99.38%。系统发育分析与序列同源性比对结果不一致，但综合生理生化特征分析，供试菌株115325可被鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。表2，图3

2.3 控制药剂筛选

研究表明，6种供试药剂对供试菌株115325均有抑制作用，苯甲酸钠和山梨酸钾随着处理浓度的增加，抑制效果减弱，相同浓度处理下，苯甲酸钠的抑菌效果好于山梨酸钾。庆大霉素、硝酸银、卡那霉素和头孢菌素随着处理浓度的增加，抑菌效果增强，同为1.0 mg/L浓度处理下，头孢菌素对供试菌株的抑菌圈最大，直径为19.91 mm，卡那霉素和硝酸银的抑菌圈直径分别为9.54和2.05 mm。表3

注：括号中的序号为 GenBank 登录号；分支点上的数字为自展值百分比

Note：GenBank accession numbers are shown in the parentheses;The number at each branch point is the percentage supported by bootstrap

图3 基于16S rDNA序列的系统发育树

Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

表2 用于构建系统发育树的菌株相关信息

Table 2 Related information of strains used for building phylogenetic tree

菌株名称Strainname菌株编号Strainnumbers登录号Accession同源性Similarity(%)StaphylococcusepidermidisATCC14990L3760599 86StaphylococcuscapraeATCC35538AB00993599 46StaphylococcussaccharolyticusATCC14953L3760299 38Staphylococcuscapitissubsp．capitisATCC27840L3759999 32Staphylococcuscapitissubsp．urealyticusGTC727AB23332599 17Staphylococcuspetrasiisubsp．petrasiiCCM8418JX13984598 71StaphylococcuswarneriATCC27836L3760398 70StaphylococcussimiaeCCM7213AY72753098 64StaphylococcusargenteusMSHR1132FR82177798 64StaphylococcusschweitzeriFSA084CCEL0100002598 57Staphylococcusaureussubsp．anaerobiusATCC35844D8335598 57Staphylococcuspetrasiisubsp．pragensisNRL/St12/356KM87366998 57Staphylococcusaureussubsp．aureusDSM20231AMYL0100000798 51Staphylococcuspetrasiisubsp．croceilyticusCCM8421AY95314898 51Staphylococcushominissubsp．hominisDSM20328X6610198 50StaphylococcushaemolyticusATCC29970L3760098 50StaphylococcuslugdunensisATCC43809AB00994198 44StaphylococcuschromogenesATCC43764D8336097 56

表3 供试药剂及其抑菌效果测定

Table 3 Supplied test fungicides and bacteriostatic effect determination

药剂名称Fungicides处理浓度与抑菌圈直径(mm)TreamentcontentandBacteriostaticcirclediameter苯甲酸钠Sodiumbenzoate0 01mol/L0 05mol/L0 1mol/L10 667 787 98山梨酸甲Potassiumsorbate0 01mol/L0 05mol/L0 1mol/L9 263 762 86庆大霉素Gentamicin0 05ml/L0 1ml/L0 2ml/L11 3112 8216 34硝酸银Silvernitrate0 1mg/L0 4mg/L1 0mg/L0 181 012 05卡那霉素Kanamycin1 0mg/L5mg/L10mg/L9 5414 6116 40头孢菌素Cephalosporin1 0mg/L5mg/L10mg/L19 9121 1623 42

3 讨 论

Leifert等[15]研究表明，外植体培养在3～5 d后才出现的细菌菌落，可能是内生菌引起的污染。在对德国鸢尾进行组织培养时发现，常常在培养10 d左右时才出现类似细菌的污染，因此推测可能是由内生菌引起的。一般来讲，在种的分类上，如果两个分类单位间的16S rDNA 序列同源性大于97.5%，可视为与模式菌株同种[16-17]。研究中供试菌株115325的16S rDNA序列与表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的同源性最高，为99.86%，而与解糖葡萄球菌(Staphylococcussaccharolyticus)的系统发育地位最为密切，序列同源性为99.38%。综合生理生化指标测定结果，最终将供试菌株115325鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。因此，在对细菌进行分类时，尤其是在近缘种的分类鉴定上，基于16S rDNA序列的系统发育分析存在着一定的局限性，需将细菌生理生化特征测定与现代分子生物学有效结合起来，才能得出更加可靠的结论，这与刘绍雄[14]等的结论是一致的。

研究鉴定的引起德国鸢尾组培苗污染的内生菌，即表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)为人和动物体内的条件致病菌[18]，在动物皮肤、肠道等器官中大量存在。因此，出现内生菌的污染可能与研究所选择的德国鸢尾组织培养外植体的生长环境有关，如施用农家肥等。

研究6种常用的防止细菌污染的食品添加剂(苯甲酸钠、山梨酸钾)和抗生素(庆大霉素、卡那霉素和头孢菌素)对供试菌株的抑制效果，认为头孢菌素(先锋霉素)和庆大霉素可作为抑制德国鸢尾组培苗内生菌污染的首选药剂，这与韩美丽[19]等在绿巨人(Spathiphyllumkochii)组织培养中研究了青霉素钠、先锋霉素和庆大霉素对继代培养中细菌污染的抑制效果，结果表明，先锋霉素的抑制效果最好，青霉素和庆大霉素次之。与细菌的结论是一致的。研究发现，随着苯甲酸钠和山梨酸钾处理浓度的增大，其对供试菌株的抑制效果却在减弱，其原因有待于进一步探索。

4 结 论

供试菌株115325与表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的16S rDNA 序列同源性最高，达到了99.86%，综合形态特征观察、生理生化指标测定及分析, 可将其鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。6种常用药剂对供试菌株115325的抑制效果差异显著，研究表明，在1.0 mg/L浓度处理下，头孢菌素对供试菌株的抑菌圈最大，直径为19.91 mm，庆大霉素0.2 ml/L处理下的抑菌圈直径达到16.34 mm。因此，头孢菌素(先锋霉素)和庆大霉素的抑制效果最好，可作为抑制德国鸢尾组培快繁过程中内生菌污染的首选药剂。

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Isolation, Identification and Screening of Endophyte Fingicides for Disease Control during Tissue Culture of German Irises

HAN Hong-wei, LIAO Qing , Marbaha Wsman, WANG Hao,ZHUANG Hong-mei, WANG Qiang, SHA Hong

(ResearchInstituteofHorticulturalCrops,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 During tissue culture of German irises, Endophytic bacteria pollution is the key problem of restricting them for rapid propagation factory nursery. For that reason, this project aims to segregate and identify endophytic bacteria that might lead to tissue culture explants pollution, and the inhibition of 6 kinds of commonly used agents on the strain effect will be compared so as to select the best preventive agent. That will provide a scientific basis for effective control of endophytic bacteria pollution during its rapid propagation. 【Method】The strain (115325) has been segregated and purified using NA medium and the endophytic bacteria were been classified and identified by morphology observation, physiological and biochemical test, and 16S rDNA sequence homology analysis. Inhibitory effects of 6 kinds of commonly used chemicals on the tested strains were determined by the method of paper disc bacteriostatic circle. 【Result】The strain (115325) of morphology characteristics and physiological and biochemical indicators were basically the same asStaphylococcusepidermidis. The results of 16S rDNA sequence homology analysis showed that the strain andsaccharolyticus(L37602) had mostly close relation in the evolution, belonging to the same phylogenetic branch. AndS.staphylococcusepidermidishad the highest homology, at 99.86%. Indoor medicament screening results showed that the cephalosporins and gentamicin had the strongest inhibitory effect on strains. 【Conclusion】The comprehensive analysis results of morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence, 115325 strains have been identified asStaphylococcusepidermidis. Cephalosporin and gentamicin can be used as the preferred agents to inhibit endophytic bacterial contamination of the German iris plantlets.

German irises; endophytes; tissue culture; identification; disease control agent

LIAO Qing(1962-)，Associate Professor，Bachelor of Agriculture，Ornamental horticulture, (E-mail)lq08270029@sina.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.009

2016-12-06

新疆维吾尔自治区科技支疆项目“鸢尾新品种引进、繁殖技术开发及园林应用示范”(201591118)

韩宏伟(1986-)，男，河南人，助理研究员，研究方向为蔬菜花卉栽培，(E-mail)hhwei2010@sohu.com

廖晴(1962-)，女，四川安岳人，副研究员，研究方向为园艺观赏学，(E-mail)lq08270029@sina.com

S681.9

A

1001-4330(2017)04-0652-08

Supported by: Supported by Xinjiang Uyghur Autonomous Region's science and technology programs "The introduction of new varieties of iris, reproduction technology development and application demonstration garden" (201591118)