于 湛, 何 妍, 戚涵姝, 谷笑雨, 刘丽艳, 苏桂田, 辛士刚

(1. 沈阳师范大学 化学化工学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳师范大学 实验中心, 沈阳 110034; 3. 沈阳师范大学 复杂体系分离与分析辽宁省高校重点实验室, 沈阳 110034)



橙皮素同2种血清蛋白相互作用的光谱研究

于 湛1,3, 何 妍1, 戚涵姝1, 谷笑雨1, 刘丽艳1, 苏桂田1, 辛士刚2

(1. 沈阳师范大学 化学化工学院, 沈阳 110034; 2. 沈阳师范大学 实验中心, 沈阳 110034; 3. 沈阳师范大学 复杂体系分离与分析辽宁省高校重点实验室, 沈阳 110034)

利用荧光光谱法以及分子对接计算研究了橙皮素同人血清白蛋白(HSA)间的相互作用,并将结果同牛血清白蛋白(BSA)进行对比。实验结果表明,橙皮素均可以通过静态猝灭的方式有效地猝灭这2种蛋白质,且猝灭常数相近,猝灭效率差别很小。橙皮素与HSA结合位点数与BSA相同,但是结合常数小于BSA,并且同步荧光光谱数据显示橙皮素与BSA和HSA的相互作用使得这2种血清蛋白的结构发生了一些变化,从而导致荧光猝灭。分子对接计算表明,橙皮素同BSA及HSA的作用方式相似,都是在疏水及氢键作用驱动下结合在BSA或HSA部分氨基酸残基形成的疏水性口袋中。

橙皮素; 人血清白蛋白; 牛血清白蛋白; 相互作用; 荧光光谱法; 同步荧光法; 分子对接

0 引 言

图1 橙皮素化学结构Fig.1 Molecular structure of hp

橙皮素(hesperetin,hp)为二氢黄酮类化合物,是柑橘类植物果实的主要药效成分及代谢产物。橙皮素具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗血小板凝聚、舒张血管、抗动脉粥样硬化及抗炎等作用[1],可抑制脂肪分解,促进DNA生物合成,此外还具有健胃、祛痰、镇咳等多种功效[1]。血清蛋白是哺乳动物体内最重要的载体蛋白,许多化学物质通过与血清蛋白结合,载运至靶位置从而完成各种生命活动[2]。因此研究活性小分子同血清蛋白的相互作用,对于了解生命过程、研究药物作用机制及设计药物分子具有重要的现实意义[3]。人血清白蛋白(HSA)与牛血清白蛋白(BSA)是最常见的2种血清蛋白,由于BSA同HSA相比具有序列相似度高、成本低廉,因此改变顺序被广泛采用[4]。本文采用荧光光谱法并辅以分子对接模拟计算,研究了橙皮素同BSA、HSA间的相互作用,并获得了结合常数、结合位点数等参数,并依此推测了复合物结构,为研究橙皮素的潜在药物应用以及药品功能开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

橙皮素(上海如吉生物科技有限公司)、HSA(美国Sigma公司)、BSA、三羟甲基氨基甲烷(Tris,美国Amersco公司)、HCl、NaOH(国药集团化学试剂有限公司)、二次去离子水。

Cary Eclipse荧光光谱仪(美国Varian 公司)、Lambda 25紫外可见分光光度计(美国Perkin Elmer公司)、FE20K 型pH计(上海梅特勒托利多公司)。

1.2 实验方法

hp使用无水乙醇为溶剂,配制为1.0×10-4mol/L储液备用;HSA与BSA 配制为1.0×10-4mol/L溶液备用;将适量Tris溶解于水后用0.1 mol/L HCl与0.1 mol/L NaOH溶液调节至pH值为5.4、6.4与7.4,其中Tris浓度为0.1 mol/L,为保证离子强度,此缓冲溶液还含有0.1 mol/L NaCl。在5 mL离心管中依次准确加入200 μL BSA(或HSA)溶液、1 mL Tris缓冲溶液以及一定量的hp储液,用去离子水定容至4 mL,随后恒温水浴一定时间后立即进行荧光测试。

荧光光谱仪参数如下:激发与发射狭缝宽度均为5 nm;λex设为280 nm;扫描范围为285～500 nm;固定波长同步荧光扫描中波长差Δλ分别为15 nm和60 nm。

BSA与HSA结构均来自于RCSB数据库(编号:4F5S与1AO6),hp结构来自pubchem网站,并通过MMFF94分子力场[5]进行结构预处理。分子对接使用Autodock 4.2程序[6]完成。格子选择选长宽高均为126Å的立方体,格子间隔为0.375Å。橙皮素分子中可旋转的单键、非极性氢原子及相关联的碳原子性质按照AutoDock Tools选取的默认值。分子对接中关于遗传算法(GA)几个重要的参数设置如下:种群数为150,能量评估最大值为2.5×106,运算循环数为100,其余参数均采用默认值。分子对接结果使用LigPlot+[7]程序分析。

1.3 荧光强度测定

本文给出的荧光发射强度均是实验直接获得的荧光发射强度经式(1)进行內滤效应校正[8]后得到。

(1)

式中:Fcorr与Fobs分别为经过与未经校正的荧光发射强度;Aex和Aem是分别是猝灭剂hp在样品溶液条件下,在激发与发射波长下的紫外-可见吸光度。校正数据见表1。

表1 BSA/HSA在不同浓度hp存在下的内滤效应校正系数

2 结果与讨论

2.1 溶液条件对于hp猝灭BSA、HSA的影响

溶液pH对于蛋白质的高级结构存在一定影响,可能会引起BSA、HSA等载体蛋白对药物小分子载运能力的改变。因此,本文选择pH为5.4、6.4以及7.4的Tris缓冲溶液,考察了溶液pH对血清蛋白荧光猝灭的影响。通过实验验证,我们发现pH对于hp猝灭BSA的影响不明显,其中pH=7.4条件下hp对于BSA的猝灭效果最强。这可能是由于pH=7.4最接近BSA的生理条件,此时BSA的结构最为舒展,hp与BSA的结合也最强。

此外本文还考察了水浴时间、水浴温度对于猝灭的影响,发现水浴温度对于猝灭影响较大,温度越低猝灭越明显,当水浴时间超过30 min,猝灭比较稳定。

2.2 hp猝灭BSA、HSA的机理分析

图2为含有浓度为2.5×10-6mol/L BSA及浓度分别为0、1、2、3、4、5、6×10-6mol/L hp的混合溶液于37 ℃下水浴30 min后的荧光发射光谱图(由于hp猝灭HSA情况与此相似,光谱图省略)。由图可见,hp对于BSA具有较强的猝灭作用。

对于荧光猝灭,可根据Stern-Volmer方程进行分析。Stern-Volmer方程如下所示:

(2)

其中:F0/F为未加入与加入猝灭剂后体系荧光强度之比;[Q]为猝灭剂浓度;Kq为双分子碰撞猝灭常数;生物大分子的平均荧光寿命τ0为10-8s[9];Ksv为Stern-Volmer 猝灭常数。

图3为上述溶液分别置于17、27及37 ℃下水浴30 min后,于347 nm处所得F0/F与[Q]关系。由图可见,在相同[Q]条件下,较低温度下的F0/F值要高于较高温度下F0/F值,而所有温度下F0/F值与[Q]均呈现良好线性关系,说明BSA及HSA与hp所形成的复合物的稳定性与温度成反比,这与文献所报道的静态猝灭规律一致[10],由此可初步判断hp猝灭BSA(或HSA)荧光可能是由于两者之间形成了非共价复合物。

图2 hp猝灭BSA的荧光光谱图

图3 hp猝灭BSA与HSA的Stern-Volmer曲线

根据Stern-Volmer方程对图2中数据计算,所得Kq与Ksv等数据列于表2。Kq均大于小分子与生物大分子相互作用的最大扩散碰撞猝灭速率常数2.0×1010L·mol- 1·s- 1,由此可推测hp对BSA和HSA都是静态猝灭。

表2 不同温度下hp对BSA与HSA猝灭常数

图4 不同温度下hp猝灭BSA与HSA双倒数曲线Fig.4 Scatchard plots for the interaction between hp and BSA/HSA under different temperatures

当发生静态猝灭,可根据双对数方程(3)计算猝灭剂对蛋白的猝灭,获知二者之间的结合常数Ka与结合位点数n。

(3)

图4为不同温度下hp猝灭BSA与HSA的双倒数图。由图可见,在相同温度下,hp同HSA的结合弱于同BSA的结合,而对于同一蛋白而言,升高温度可提高结合常数,并且hp与这2种血清白蛋白均形成1∶1型复合物。

小分子同蛋白质所形成的复合物中两者之间作用力主要包括疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等[11]。根据热力学公式lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R对表3中Ka与T进行线性拟合,可以获得hp与BSA及HSA结合的ΔH、ΔS及ΔG,所得结果列于表4中。

表3 hp与BSA/HSA的结合位点数n

表4 hp与BSA及HSA结合的热力学参数

根据Ross等人[12]所总结出的小分子与生物大分子的经验规律对表4数据分析可知,hp同BSA及HSA结合的ΔH与ΔS都大于零,说明这种复合物是基于疏水作用力结合的,而反应的ΔG均小于零,说明复合反应均为自发进行的吸热反应。

2.3 hp猝灭BSA、HSA的同步荧光分析

同步荧光光谱是研究研究蛋白质构象的一种有力手段,近年来广泛应用在小分子和生物大分子的相互作用的研究领域中。为研究复合物中hp对两种血清蛋白构象的影响,本文分别选用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱法研究Tyr与Trp残基发光的变化。这两种氨基酸残基的最大发射波长与其所处的微环境的极性有关,若其所处环境的疏水性逐渐增加,则最大发射波长会发生蓝移,反之,则发生红移。因此,根据最大发射波长的改变可以判断蛋白质构象的变化[13]。由图5的hp猝灭HSA同步荧光光谱图可以看出,随着hp浓度的增加,HSA的荧光发射出现了红移现象,这说明hp可以改变HSA的构象,使Trp和Tyr所处环境的疏水性减弱。此外,还可以看出hp对于Trp发光的猝灭程度大于Tyr,因此可推测hp在HSA上的结合位置可能在Trp残基附近。hp猝灭BSA的同步荧光光谱图与HSA的情况相似,本文不再重复给出。

2.4 分子对接结果分析

本文利用AutoDock软件对hp与BSA及HSA所形成的1:1型非共价复合物进行分子对接研究,分析hp同2种血清蛋白之间的结合模型,并通过LigPlot+程序[14-15]分析复合物中hp与BSA和HSA之间的氢键及疏水作用。

由图5a可以看出,疏水与氢键作用在hp与BSA之间的主要作用力,也是hp与BSA结合形成复合物的主要驱动力[16-17]。BSA的Leu24、Lys20、Phe36、Val40、Lys132、Lys131、Trp134、Gly21、Glu17、Asn44等残基形成一个疏水性口袋,hp结合在其中。复合物中,hp与Glu17及Asn44之间均存在<3Å的氢键作用。我们推测,在hp进入这个疏水口袋后,Trp134附近的微环境受到一定程度的改变,从而促使BSA的荧光发射发生猝灭。HSA的情况(详见图5b)与此类似,不再赘述。

(a) Δλ=15 nm; (b) Δλ=60 nm

图6 A、B分别为hp与BSA和HSA的分子对接结果(虚线以及数字代表客体分子与氨基酸残基之间的氢键作用,放射状半圆表示客体分子与氨基酸残基之间的疏水作用)

3 结 语

本实验利用荧光光谱结合分子模拟技术研究了hp对BSA与HSA的猝灭作用,通过实验得到:在水浴温度为37 ℃、水浴时间30 min、pH为7.4的条件下,hp对BSA及HSA的猝灭最为明显。本文根据Stem-Volmer方程求得hp猝灭BSA及HSA的类型为静态猝灭,主客体之间形成了复合物,并根据双对数方程计算了这些复合物的结合常数及结合位点数。同步荧光光谱法还揭示了hp在2种血清蛋白上的结合位点均在Trp残基附近。分子对接计算结果表明hp结合在BSA与HSA中部分氨基酸形成的疏水口袋中,主客体之间存在较强的疏水作用及氢键作用。

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The spectroscopic study of intermolecular interactions between hesperetin and two serum albumins

YU Zhan1,3, HE Yan1, QI Hanshu1, GU Xiaoyu1, LIU Liyan1, SU Guitian1, XIN Shigang2

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 2. Experimental Center, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 3. Provincial Key Laboratory for Separation and Analysis of Complex Systems in Liaoning Universities, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

The interaction between hesperetin and human serum albumin(HSA) was investigated in this work, contrasted with the interaction between hesperetin and bovine serum albumin(BSA), by the method of fluorescence spectroscopy and molecular docking simulation. Experimental results show that the fluorescence of both BSA and HSA can be effectively quenched by the addition of hesperetin due to the static quenching mechanism. The quenching constants for the two proteins are similar and quenching efficiency are also alike. The numbers of binding sites of hesperetin to BSA and HSA are same but the binding constant of hesperetin and HSA are smaller than that of BSA. Synchronous fluorescence study indicates that the presence of hesperetin leads to slightly structural changes of proteins which causes fluorescence quenching of BSA and HSA. Molecular docking simulation shows that hydrophobic interactions and hydrogen bonding drive BSA and HSA to include hesperetin in their hydrophobic pockets formed by some amino acid residues of theirs.

hesperetin; human serum albumin; bovine serum albumin; interaction; fluorescence spectroscopy; synchronous fluorescence spectroscopy; molecular docking

1673-5862(2017)02-0208-06

2016-03-12。

国家自然科学基金资助项目(21205080); 教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留[2012]1707); 辽宁省高等学校优秀人才支持计划(LJQ2015105)。

于 湛(1978-),男,辽宁沈阳人,沈阳师范大学副教授,博士。

TQ460.1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.02.017