李晓波 李燕(通讯作者)

650031昆明理工大学附属昆华医院干部保健科

非酒精性脂肪肝病动物模型的探讨

李晓波 李燕(通讯作者)

650031昆明理工大学附属昆华医院干部保健科

目的：探讨非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型的建立。方法：选择雄性SD大鼠40只，平均分为对照组和实验组，实验高脂灌胃12周后，分别处死大鼠各半，肝脏组织切片HE染色，测定肝功、血脂，称取大鼠体重及肝脏重量，进行统计学处理分析。结果：高脂饮食可以成功建立大鼠NAFLD模型。结论：高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，简单易行，成本低，方便临床进行NAFLD发病机制、药物干预的研究。

非酒精性脂肪肝病；动物模型；高脂饮食

非酒精性脂肪肝病是一种临床较为常见的肝脏疾病，主要指患者无大量饮酒史，但在对肝脏进行检查时显示肝脏出现脂肪变性的特征。除脂肪变性的特点外，患者还常伴有肝细胞损伤、肝癌甚至肝功能衰竭等[1]。临床上根据肝脏损伤的程度，把NAFLD分为单纯性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及脂肪堆积引起的相关肝硬化等。NAFLD发病率呈上升趋势，中国城市发病率约30%[2]，对人们的健康和生活产生严重的影响。NAFLD的发病机制、治疗已成为研究热点。肝组织活检可判定NAFLD病理学改变，为诊断及判定NAFLD病情的金标准。但NAFLD的肝脏组织病理学诊断在人体难以实现，且药物干预后人体肝脏病理学变化难以进行观察，选择一种简单易行、稳定的动物模型极为重要。目前国内外常用的NAFLD动物模型有很多种，但是，其中最为理想的动物模型必须有下面这些特点：①在动物模型中建立的疾病，其特征必须与人类所患疾病的特征相似；②该病变有一定的发生和发展过程；③动物模型易于建立，在建立模型的过程中动物的死亡率低，并且重复性好。本研究对高脂灌胃构建NAFLD大鼠模型方法进行探讨，现报告如下。

资料与方法

实验动物：雄性SD大鼠40只，由昆明医科大学动物实验中心提供，体重160～180 g。基础饲料配方为每1 000 kg饲料含玉米粉440 kg，豆饼170 kg，大米粉150 kg，鱼粉100 kg，麦麸100 kg，酵母粉20 kg，骨粉10 kg，食用盐10 kg，分为对照组和实验组，各20只。

高脂溶液的配制和灌胃：97%的猪油+2%的胆固醇+1%的胆酸钠配成100%的高脂溶液，实验组大鼠灌胃量为1 g高脂溶液/100 g大鼠体重。每天早7：00-9：00灌胃，12周后随机选取两组各10只(造模期间有2只大鼠死亡)，处死大鼠，收集血清、肝脏组织检测相应指标；肝脏HE染色，光镜下观察肝脏病理学改变。检验NAFLD模型是否成功。

统计学方法：采用SPSS 19.0分析，计量资料采用(±s)表示，采用t检验，计数资料使用(%)表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

肝脏切片HE染色：在本研究中，动物模型建立完成后，分别对两组大鼠的肝脏进行切片HE染色观察，在对照组，其切片HE染色后发现肝脏细胞没有任何炎性反应和脂肪颗粒沉积；而在灌胃组，每个大鼠的肝脏组织均存在一定程度的脂肪浸润和炎性反应，严重者已经达到了重度脂肪肝水平，见图1。

肝功能：两组肝功能指标比较，实验组大鼠AST、ALT以及AKP明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

血脂：实验组CHOL、TG以及LDL明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

大鼠肝重与体重比：实验组和对照组相比，肝脏重量与大鼠体重的百分比明显升高，差异有统计学意义(P＜ 0.05)，见图2。

图1 灌胃12周后大鼠肝脏切片HE染色(A与C是实验组大鼠，B与D是对照组大鼠)(20×20)

表1 灌胃12周后大鼠肝功能比较(±s，U/L)

表1 灌胃12周后大鼠肝功能比较(±s，U/L)

注：与空白对照组相比，⋆P＜0.05。

项目 对照组 实验组天门冬氨酸氨基转移酶(AST) 233±44.7 537±232.6⋆丙氨酸氨基转移酶(ALT) 68±12.96 123±40.37⋆碱性磷酸酶(AKP) 47±6.844 155±44.82⋆

表2 灌胃12周后大鼠血脂指标比较(±s，g/L)

表2 灌胃12周后大鼠血脂指标比较(±s，g/L)

注：与对照组相比，⋆P＜0.05。

项目 空白组 实验组总胆固醇(CHOL) 1.13±0.16 1.63±0.35⋆甘油三酯(TG) 0.16±0.04 0.27±0.09⋆高密度脂蛋白胆固醇(HDL) 0.5±0.11 0.44±0.06低密度脂蛋白胆固醇(LDL) 0.33±0.09 0.58±0.12⋆

讨论

目前国内外常用的NAFLD动物模型可分为4类：①基因改良模型；②食物、药物、毒物诱导模型；③基因饮食复合模型；④中医模型。常用模型动物有大鼠、小鼠、家兔等。其中基因模型成本高；药物及毒物诱导模型在发病机制、演变过程及组织病理形态等方面与人类脂肪肝差异大，且药物毒性强，死亡率高；复合模型没有统一的建模标准；中医模型难度大[3]。而高脂饮食模型在病因、病理等方面与人类NAFLD发病机制最为相似。高脂饮食模型具有肥胖、高脂血症等代谢综合征表现，镜下可见大细胞性脂肪变性、气球样变性等[4]。

本次研究采用高脂饮食灌胃的方法，成功构建了NAFLD大鼠模型：①肝脏切片HE染色：在本研究中，动物模型建立完成后，分别对两组大鼠的肝脏进行切片HE染色观察。在对照组，其切片HE染色后发现肝脏细胞没有任何炎性反应和脂肪颗粒沉积，而在实验组，每个大鼠的肝脏组织均存在一定程度的脂肪浸润和炎性反应，严重者已经达到了重度脂肪肝水平；②实验组CHOL、TG以及LDL明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；③实验组与对照组相比，肝脏重量与大鼠体重的百分比明显升高，这可能与肝脏中的脂质沉积有关。本研究的高脂溶液中加入少量胆酸盐，可增加外源性胆固醇的吸收[5]。

图2 大鼠处死时肝脏占体重百分比注：实验组与对照组相比，P＜0.05。

综上所述，高脂饮食建立NAFLD大鼠模型简单易行，成本低，方便临床进行NAFLD发病机制、药物干预的研究。

[1]Verbeek J,Cassiman D,Lannoo M,et al.Treatment of non-alcoholic fatty liver disease：can we already face the epidemic?[J].Acta Gastroenterol Belg,2013,76(2)：200-209.

[2]Liu JJ,Chen YY,Mo ZN,et al.Relationship between Serum Osteocalcin Levelsand Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in Adult Males,South China[J].Int J Mol Sci,2013,14 (10)：19782-19791.

[3]黄海燕,辛永宁,姜曼,等.非酒精性脂肪性肝病动物实验模型研究进展[J].临床肝胆病杂志,2014,30(9)：948-953.

[4]REDDYSK,ZHAN M,ALEXANDER HR,et al.Nonalcoholic Fatty Liver Disease is associated with benign gastrointestinal disorders [J].World J Gastroenterol,2013,19(45)：8301-8311.

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Discussion on nonalcoholic fatty liver disease animal model

Li Xiaobo,Li Yan(Corresponding author)
Health Care For Cadres,Kunhua Hospital Affiliated to Kunming University of Science and Technology 650031

Objective：To explore the establishment of nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)rat model.Methods：40 male SD rats were selected.They were divided into the blank control group(CON)and the high-fat diet group(HFD).After 12 weeks of high fat feeding,half of the rats were executed.Liver tissue was given HE staining.We measured the liver function and blood lipids.The weight and liver weight of rats were measured.We performed statistical analysis of all the data.Results：High fat diet can successfully establish rat NAFLD model.Conclusion：The establishment of NAFLD rat model with high fat diet was simple and easy,and the cost was low.It was convenient to study the pathogenesis and drug intervention of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease;Animal model;High fat diet

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.10.1

云南省科技厅-昆明医科大学联合专项(2011FB225)

Fund projectJoint special of Yunnan science and technology department-Kunming Medical University(2011FB225)