赵鹏飞李云萍李晓明宋祥义苏明红左世锋杨玉宝*

（1 沂南县人民医院，山东 临沂 276300；2 山东医专附属医院，山东 临沂 276000）

BMP-2在正常与坏死股骨头骨组织中的表达差异

赵鹏飞1李云萍1李晓明1宋祥义1苏明红1左世锋1杨玉宝2*

（1 沂南县人民医院，山东 临沂 276300；2 山东医专附属医院，山东 临沂 276000）

目的 通过荧光原位杂交及RT-PCR实验方法观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）在正常与缺血坏死性股骨头骨组织中的表达差异，探讨BMP-2在两种骨组织中的变化规律。方法 取股骨粗隆间骨折及缺血坏死性股骨头需行人工股骨头置换或全髋人工关节置换的正常股骨头、缺血坏死性股骨头骨组织患者各8例；分别取组织2～5 g放入冷冻管存入液氮用于荧光原位杂交及BMP-2基因的RT-PCR。结果 BMP-2的荧光原位杂交图像显示正常骨组织中的表达量比坏死组织增多，RT-PCR的2-ΔΔCt平均值分别为0.55±0.35，0.45±0.20；正常股骨头骨组织中BMP-2基因RT-PCR的2-ΔΔCt平均值与缺血坏死性股骨头骨组织平均值相比P＜0.05。结论 BMP-2基因在正常与缺血坏死性股骨头骨组织有统计学意义，因此BMP-2基因表达量的减少也许是股骨头缺血坏死的重要原因之一。

正常股骨头；缺血坏死性股骨头；荧光原位杂交；聚合酶链反应

股骨头坏死实际上是由多种因素所致股骨头供血不足，或者是骨细胞变性引发的骨骼的活性成分死亡的病理学过程。目前国内外都对其进行发病及进展过程做了大量实验研究，但具体发病机制尚不完全清楚。随着大量与骨折及骨坏死吸收及再生等相关细胞因子不断被认识，临床实验研究发现有些细胞因子在治疗早期股骨头坏死方面有肯定的疗效，骨形态发生蛋白-2（BMP-2）就是其中之一。

1 资料与方法

1.1 一般资料：在2014年6月至2016年1月于沂南县人民医院取股骨粗隆间骨折需行人工股骨头置换或全髋人工关节置换的正常股骨头骨组织8例；取酒精缺血坏死性股骨头需行人工股骨头置换或全髋人工关节置换骨组织8例，年龄在56～78岁，平均年龄（64.33±6.14）岁。

1.2 标本采取和保存方法：患者取健侧卧位，取髋关节后外侧常规切口，股骨头取出后，在手术台上用骨刀把股骨头纵向剖开，不用电锯剖开以免电锯摆动时产生高能量引起蛋白变性而影响实验数据，在实行股骨髓腔处理时用开口器取大粗隆处骨组织2～3 g，在2 min将正常股骨头及缺血坏死性股骨头、粗隆间骨组织各2～3 g，放入冷冻管存入液氮用于实验。

1.3 受试病例排除标准：股骨粗隆间骨折及缺血坏死性股骨头需人工股骨头置换或全髋人工关节置换的患者，尽量选择无高血压、糖尿病，严重冠心病及免疫系统疾病。排除儿童患者和能够非手术治疗患者。对取标本患者向其家属说明原因，有家属或本人在手术或告知知情同意书上签字。

1.4 FISH检测：①切片预处理：石蜡包埋的组织芯片切片3 μm厚，置于干净的涂胶片上，56 ℃下过夜烘烤，次日室温条件下二甲苯中脱蜡10 min×2次，无水乙醇5 min，100%、85%、70%乙醇中各3 min，再将涂胶片浸入蒸馏水中5 min。高压修复2 min，胃酶工作液37 ℃消化9～15 min。室温条件下于2×SSC溶液中漂洗5 min，1%多聚甲醛PBS 10 min，2×SSC溶液中漂洗5 min，梯度乙醇75%、85%、100%中各3 min，自然晾干玻片。②变性杂交：暗处滴加10 μL探针，加盖盖玻片，树脂胶封边，上杂交仪（变性83 ℃，8 min，杂交42 ℃，16 h）。③洗涤对比染色：暗处取出切片揭去封胶，室温浸于2×SSC液中使盖玻片自然脱落，37 ℃，50%甲酰胺2×SSC15 min，2×SSC 15 min，梯度乙醇75%、85%、100%中各3 min，自然干燥玻片，滴加DAPI封片，放置15 min后于荧光显微镜下观察。

1.5 RT-PCR：TaKaRa RNAiso Reagent试剂提取骨组织Total RNA，并进行逆转录及PCR反应，操作按说明书进行，其中RT反应条件为：96 ℃变性2 min，cDNA合成42 ℃ 30 min。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min，变性20 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸5 min，步骤2～4为35个循环，BMP-2退火温度为55 ℃，GAPDH退火温度为57 ℃。BMP-2引物序列：5’-GGTATCACGCCTTTT ACTGCC-3’，GAPDH引物序列：5’-TGTTGCCATCAATGACCCCT T-3’。（RT-PCR相关试剂及试剂盒有北京博奥有限责任公司提供）。

2 结 果

2.1 BMP-2的荧光原位杂交表达图像：见图1、2，图1示正常骨组织BMP-2表达阳性，图2示坏死股骨头BMP-2表达阴性。

图1 正常骨组织（×200）

图2 坏死骨组织（×200）

2.2 BMP-2基因的RT-PCR：见表1。

表1 BMP-2在正常及缺血坏死性股骨头组织RT- PCR结果（2-ΔΔCt，）

表1 BMP-2在正常及缺血坏死性股骨头组织RT- PCR结果（2-ΔΔCt，）

注：两组比较与正常股骨头骨组织相比P＜0.05，有统计学意义，可以认为正常股骨头组织中的BMP-2的相对表达量高于坏死骨组织

组别2-ΔΔCt和相对值正常股骨头组织0.55±0.35坏死股骨头组织0.45±0.20 P 0.019 t 0.36

3 讨 论

股骨头坏死又称股骨头缺血性坏死，目前国内外临床研究均证实，股骨头坏死发生的主要原因是股骨头内部供血中断，导致患者骨髓成分或骨细胞死亡。股骨头坏死的主要临床症状为患者髋部疼痛，下肢活动逐渐受限，且夜间症状相对明显。如患者得不到及时、有效的治疗，其病情将可能逐渐加重，甚至影响患者走路。在治疗上，越早期给予治疗干预，患者疗效越好，因此，早期准确诊断及早期给予治疗干预可有效改善患者预后，提高疗效。

BMP-2是重要的成骨诱导因子，近年来随着对BMP-2作用机制研究的深入，以及组织工程和基因治疗技术的迅速发展，为治疗骨坏死提供了新途径，BMP有诱导成骨作用，其中BMP-2成骨诱导作用最强，是最有前途的骨诱导物质[1]。BMP-2存在于骨基质中，能够诱导未分化的干细胞分化为成骨细胞，在骨形成与修复中起重要作用[2]。通过对吸附质粒DNA转染丙交脂/胶原蛋白Ⅰ重组人骨形态形成蛋白-2（rhBMP-2）复合物在小鼠肌肉囊模型的生长情况观察发现rhBMP-2mRNA和蛋白质表达和刺激了异位骨形成[3]。有实验研究重组人骨形态形成蛋白-2（rhBMP-2）负载壳聚糖（CS）/硫酸葡聚糖（DS）复合物的异味成骨作用的实验中发现通过微CT检查发现，rhBMP-2/CS/DS微粒比单一rhBMP-2具有较强异位骨形成的能力[4]。Li[5]等通过研究表明rhBMP-2悬浮在纤维蛋白中能表现出更强的促进兔子的骨形成作用。Sun wei[6]等在研究重组人类骨形成蛋白- 2在治疗股骨头骨坏死对移植骨骼的影响中的实验发现，经过平均6.1年的随访观察，并通过X线和CT平扫评估疗效，发现rhBMP-2可提高临床疗效和骨修复质量。Ma[7]等也通过实验证实VEGF-165/BMP-2基因转染骨髓间充质干细胞（bmsc）可在数量和质量上加强成骨的影响，加速股骨头骨坏死的修复合新骨的生成。

本实验取正常股骨头、缺血坏死性股骨头骨组织进行BMP-2的荧光原位杂交和RT-PCR检测，来了解正常股骨头、缺血坏死性股骨头骨组织存在的BMP-2差异。实验证明BMP-2基因正常股骨头和缺血坏死性股骨头骨组织中RT-PCR的2-ΔΔCt平均值分别为0.55±0.35、0.45 ±0.20；正常股骨头骨组织中BMP-2基因RT-PCR的2-ΔΔCt平均值与缺血坏死性股骨头骨组织相比P＜0.05。了解BMP-2基因在两种骨组织中的变化规律为股骨头缺血性坏死的治疗提供必要的理论依据。虽然BMP-2治疗股骨头坏死的动物模型和临床前期实验都取得了显著成效，但仍然有许多问题有待更深入地去探索和研究。

当然，本实验仅通过荧光原位杂交及RT—PCR检测了解了BMP-2在正常和坏死股骨头骨组织的表达和分布，要想确切了解BMP-2治疗股骨头缺血坏死具体机制，还需从分子生物学基础之上对其机制得到更全面的了解。

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The BMP - 2 Different Expression in the Normal and Necrosis of Femoral Head

ZHAO Peng-fei1, LI Yun-ping1, LI Xiao-ming1, SONG Xiang-yi1, SU Ming-hong1, ZUO Shi-feng1, YANG Yu-bao2
(1 Yinan County People's Hospital, Linyi 276300, China; 2 Shandong Medical College Affiliated Hospital, Shandong Province, Linyi 276000, China)

Objective By fluorescence in situ hybridization and rt-pcr method to observe the BMP - 2 (BMP-2) expression differences in the normal and ischemic and necrotic femoral head bone, BMP-2 variation in two kinds of bone tissue. Methods Intertrochanteric fractures and ischemic and necrotic femoral head requires artificial femoral head replacement or total hip joint replacement of normal femoral head, all the 8 patients with ischemic and necrotic femoral head bone tissue; respectively in group 2-5 g in liquid nitrogen freezing tube used in fluorescent in situ hybridization and BMP-2 gene RT-PCR. Results BMP-2 of fluorescence in situ hybridization images show that the amount of expression in normal tissue than the necrotic tissue increased, RT-PCR2-ΔΔCtaverage is (0.55±0.35) and (0.45±0.20); in normal femoral bone BMP-2 gene RT-PCR2-ΔΔCtaverage compared with average ischemic and necrotic femoral head bone tissue P＜0.05. Conclusion BMP-2 gene in normal and ischemic and necrotic femoral head bone tissue was statistically significant, therefore decreases may BMP-2 gene expression is one of the important reasons of the ischemic necrosis of the femoral head.

Normal femoral head; Ischemic and necrotic femoral head; Fluorescence in situ hybridization; Polymerase chain reaction

R687.3

B

1671-8194（2017）10-0031-02

*通讯作者