黄旭，张浪，郝吉，程卓，冯天辉，舒广文

（中南民族大学药学院化学生物学系，湖北武汉430074）

石见穿多糖对脂多糖和D-氨基半乳糖胺联合诱导小鼠急性肝衰竭的保护作用

黄旭，张浪，郝吉，程卓，冯天辉，舒广文

（中南民族大学药学院化学生物学系，湖北武汉430074）

目的研究石见穿多糖（PSSC）对脂多糖（LPS）/D-氨基半乳糖胺（GaIN）诱导小鼠急性肝衰竭（ALF）的保护作用及可能机制。方法将昆明小鼠随机分为正常组、模型组、PSSC 30和100 mg·kg-1给药组。给药组每日1次，连续给药1周。给药结束后，除正常组外，其余各组ip给予LPS 10μg·kg-1和GalN 700 mg·kg-1，制备小鼠ALF模型。HE染色法检测肝组织病理变化；用试剂盒法检测血清谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）及肝过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平；DCFH-DA荧光探针法检测肝组织活性氧（ROS）的相对含量；ELISA法测定血清及肝组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和IL-6的含量；胱天蛋白酶3活性测试试剂盒检测小鼠肝组织匀浆中胱天蛋白酶3的活性。结果与正常对照组相比，模型组小鼠肝细胞排列杂乱，胞质皱缩，细胞边界模糊，可见较大量的炎症细胞浸润和明显的肝组织内出血，病理评分明显升高（P＜0.01）；MDA和ROS含量分别升高至正常对照组的2.2倍和4.3倍（P＜0.01），GSH含量下降至51%（P＜0.01），抗氧化酶SOD，CAT和GSH-Px的活性分别降低至74%，36%和42%（P＜0.01），TNF-α，IL-1β和IL-6的水平有明显提高（P＜0.01），胱天蛋白酶3活性升高至正常对照组的5.3倍（P＜0.01）。与模型组相比，PSSC组小鼠存活比例明显升高（P＜0.01）；小鼠肝组织病理评分降低（P＜0.01）；MDA和ROS含量升高（P＜0.01），GSH含量下降（P＜0.01）；TNF-α，IL-1β和IL-6的含量降低（P＜0.01）；胱天蛋白酶3活性降低（P＜0.01）。结论PSSC对LPS和GalN联合诱导的小鼠ALF具有良好的缓解作用，该作用可能与降低肝氧化应激、抑制肝炎症反应和细胞凋亡相关。

多糖，石见穿；急性肝衰竭；脂多糖；氨基半乳糖

急性肝衰竭（acute liverfailure，ALF）是一种由短时间内肝细胞大量死亡而导致的一种严重临床综合征，死亡率极高。目前临床上特异性地针对ALF的有效治疗手段仍然十分缺乏［1］。石见穿（Salvia chinensis Benth.）是唇形科植物华鼠尾草的干燥地上部分，主产于苏、皖、赣、湘、鄂、粤和桂等省区。传统中医认为，石见穿活血化瘀、清热利湿和散结消肿，可用于治疗湿热黄疸、热毒血痢、风湿骨痛、带状疱疹、麻风和跌打伤肿等病症［2-3］。临床上常将该药材用于炎症及肿瘤相关疾病的治疗。多糖是石见穿药材的主要化学成分之一。植物来源的多糖具有广泛的生物学活性［4-6］。石见穿多糖（polysaccharides from S.chinensis，PSSC）具有显著的免疫调节活性［7-8］。免疫细胞和免疫因子在ALF发生发展过程中扮演了重要角色。然而，目前关于PSSC对ALF药效作用的理论研究尚不完善。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和D-氨基半乳糖胺（D-galactosamine，GalN）联合诱导小鼠ALF是实验室常用的ALF动物模型。本研究用该模型评价了PSSC对ALF的缓解作用，并对可能的机制进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂和仪器

昆明种雄性小鼠，8周龄，购自湖北省疾病预防控制中心，SPF级动物许可证书编号：SCXK（鄂）2015-0018。实验小鼠饲养于中南民族大学药学院的无特定病原体屏障系统内。实验动物房环境设施许可证号：SYXK（鄂）2016-0089。本研究所有涉及实验动物的实验操作均经过中南民族大学实验动物伦理委员会审批。小鼠饲养1周适应环境后开始实验。

PSSC的制备参考文献［9］。将石见穿药材磨成粉末，石油醚萃取去除脂质，过滤干燥，按1∶10比例加入双蒸水，于90°C回流提取2.5 h，提取4次，合并提取液浓缩到500 mL。再按1∶4的比例加入95%乙醇，静置过夜，抽滤得粗多糖。将粗多糖溶于适量双蒸水，用Sevage试剂抽提4次以除去蛋白，而后再次乙醇沉淀。用丙酮洗涤沉淀，挥干丙酮后即得PSSC。

LPS、GalN和活性氧（reactive oxygen spe⁃cies，ROS）荧光探针DCFH-DA（美国Sigma公司）。谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transami⁃nase，GOT）、谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic trans⁃aminase，GPT）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（上海源叶生物科技公司）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。肿瘤坏死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6含量测定试剂盒（南京建成生物技术研究所）。胱天蛋白酶3活性检测试剂盒（碧云天生物技术公司）。

5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；L-550台式低速离心机（湖南湘潭离心机有限公司）。354多功能酶标仪（美国Thermo公司）；cp114电子天平（美国奥豪斯仪器有限公司）。ZH-2自动涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）。970CRT型荧光分光光度计（上海三科仪器有限公司）。

1.2 实验分组及处理［10］

40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、PSSC 30和100 mg·kg-1给药组。给药组分别ig给予PSSC 30或100 mg·kg-1，其余各组ig给予等体积生理盐水，每天1次，连续1周。最后一次给药结束2 h后，模型组和给药组ip给予LPS 10μg·kg-1和GalN 700 mg·kg-1制备ALF模型，正常组ip给予等体积生理盐水。

1.3 小鼠存活情况观察及肝指数

观察各组小鼠24 h内存活情况，每3 h记录1次。在小鼠濒死时（存活小鼠则在造模24 h后）麻醉处死，解剖摘取肝，称重，计算肝指数。肝指数=肝质量（g）/体质量（g）×100。将部分肝组织置于10%中性甲醛中固定，用于组织病理检测，其余冷冻保存，用于生化分析。

1.4 HE染色检测肝组织病理变化

将1.3肝组织块切成4μm厚的切片，HE染色。光学显微镜下进行组织病理观察，对小鼠肝组织病理进行半定量评分［11-12］。0分：肝细胞排列整齐、致密，无组织内出血，无炎症细胞浸润；1分：肝细胞排列疏松，可见部分空泡变性，有少量组织内出血或炎症细胞浸润；2分：部分肝组织显微结构和肝细胞形态破坏，伴有部分组织内出血或炎症细胞浸润；3分：大面积肝症显微结构和肝细胞形态破坏，伴有明显的组织内出血或炎症细胞浸润。

1.5比色法检测血清和肝组织生化指标

在小鼠濒死状态下（存活小鼠则在造模24 h后）进行眼眶静脉丛取血，分离血清，血清中GPT和GOT水平以及肝组织中MDA，GSH，SOD，CAT，GSH-Px和胱天蛋白酶3水平均按试剂盒说明书进行测定。

1.6 DCFH-DA荧光探针法定测定肝组织中ROS的相对含量

将适量的肝组织悬浮在冰冷的含（mmol·L-1）Tris-HCl（pH 7.4）20，MgCl25，KCl130，NaH2PO420和葡萄糖30的缓冲液中，研磨均匀成组织匀浆。将组织匀浆于4°C，12 000×g离心15 min，取上清液。向上清液中加入终浓度为5μmol·L-1的DCFH-DA，混匀，37°C孵育15 min后，加入终浓度为1μmol·L-1H2O2终止反应，在荧光分光光度计上测定荧光强度（fluorescence intensity，FI），以实验组FI/对照组FI比值表示ROS的相对含量［10］。

1.7 ELISA法测定血清和肝细胞炎症因子的含量

血清和肝匀浆中TNF-α，IL-1β和IL-6的含量测定均按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.8 统计学分析

实验结果数据用x±s表示。采用t检验比较2个给药组数据差别的统计学意义。采用Kaplan-Meier检验法比较给药对小鼠存活的影响。如＞2个组（如模型组和两个给药组的比较），则先采用单因素方差分析比较多个组的数据差异，然后采用Scheffe法进行均数的两两比较。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 石见穿多糖对急性肝衰竭小鼠存活的影响

如图1结果显示，ALF模型小鼠12 h有7/10存活，24 h有2/10存活。PSSC 30 mg·kg-1组小鼠12 h有8/10存活，24 h有5/10存活；PSCC 100 mg·kg-1组小鼠12 h有9/10存活，24 h有7/10存活。采用Kaplan-Meier检验法，与模型组比较，PSSC 100 mg·kg-1组小鼠存活比例明显提高，2条生存曲线存在统计学差异（P＜0.01），提示PSSC对LPS和GalN联合诱导的小鼠死亡具有缓解作用。

2.2 石见穿多糖对急性肝衰竭小鼠肝组织病理及肝指数的影响

Fig.1 Effect of polysaccharides from S.chinensis（PSSC）on survival of LPS and GalN-induced acute liver failure（ALF）mice.The mice of PSCC groups were ip given PSCC 30 or 100 mg·kg-1once a day，for a week.Other groups were ip given with equal volumes of saline.Two hours after drug treat⁃ment，modeland PSSC groups were ip injected with LPS 10μg·kg-1and GalN 700 mg·kg-1.n=10.Compared with modelgroup，the survivalcurve of PSSC 100 mg·kg-1group was of statisticaldiffer⁃ence（P＜0.01）.

小鼠肝组织显微病理结果（图2）显示，正常对照组肝细胞紧凑排列，胞质充盈，无明显炎症细胞浸润和组织内出血。模型组肝细胞排列杂乱，胞质皱缩，细胞边界模糊，可见大量的炎症细胞浸润和明显的肝组织内出血。半定量评分结果表明，与正常对照组比较，模型组肝组织病理评分升高（P＜ 0.01），是正常组对照组的9.3倍；与模型组比较，PSSC 30和100 mg·kg-1组肝组织病理评分则分别下降至57%和25%（P＜0.01）（表1）。肝指数结果（表1）显示，与正常组对照组相比，模型组小鼠肝指数升高（P＜0.01），是正常对照组的1.26倍；与模型组相比，PSSC 30和100 mg·kg-1组肝指数分别下降至86%和78%（P＜0.01），提示PSSC 30和100 mg·kg-1可缓解LPS和GalN联合诱导的肝损伤。

Tab.1 Effect of PSSC on liver indexes and pathological scores of ALF mice

2.3 石见穿多糖对急性肝衰竭小鼠血清转氨酶活性的影响

血清GPT和GOT活性分析结果（表2）显示，模型组小鼠血清GPT和GOT活性升高（P＜0.01），分别是正常对照组的86.8和12.8倍，提示模型组小鼠出现肝细胞损伤。与模型组相比，PSSC 30和100 mg·kg-1组显著降低LPS和GalN联合诱导的血清GPT和GOT活性升高（P＜0.01），血清GPT分别下降至21%和3%，血清GOT分别下降至49%和16%。

Tab.2 Effect of PSSC on activity of glutamic-pyruvic transaminase（GPT）and glutamic-oxalacetic trans⁃aminase（GOT）in serum of ALF mice

Fig.2 Effect of PSSC on liver pathologicalmorphology of ALF mice detected by HE staining.See Fig.1 for the mouse treatment.Arrows indicate hepatic hemorrhage or infiltration ofinflammatory cells.

2.4 石见穿多糖对急性肝衰竭小鼠肝氧化应激酶含量及抗氧化酶活性的影响

氧化应激酶含量检测结果（表3）显示，与正常对照组比，模型组小鼠肝组织中MDA含量上升（P＜0.01），是正常对照组的2.23倍；抗氧化因子GSH含量则下降至51%（P＜0.01），ROS的相对含量上升（P＜0.01），是正常对照组的4.31倍；提示ALF模型小鼠肝组织中出现明显的氧化应激。与模型组相比，PSSC 30和100 mg·kg-1组小鼠肝组织中MDA和ROS的含量降低（P＜0.01），GSH含量升高（P＜0.01），提示PSSC 30和100 mg·kg-1可缓解ALF模型小鼠肝组织中出现的氧化应激。

抗氧化酶活性检测结果（表4）显示，与正常对照组比，模型组小鼠肝组织中SOD，CAT和GSH-Px活性降低（P＜0.01）；与模型组相比，PSSC 30和100 mg·kg-1组小鼠肝组织中SOD，CAT和GSH-Px活性升高（P＜0.01）。

2.5 石见穿多糖对急性肝衰竭小鼠血清和肝组织炎症因子含量的影响

小鼠血清（表5）及肝组织（表6）炎症因子含量检测结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清和肝组织中TNF-α，IL-1β和IL-6的含量增加（P＜0.01）。与模型组相比，PSSC 30和100 mg·kg-1组小鼠血清和肝组织中TNF-α，IL-1β和IL-6含量降低（P＜0.01）。

2.6 石见穿多糖对急性肝衰竭小鼠肝组织胱天蛋白酶3活性的影响

小鼠肝组织中胱天蛋白酶3活性检测结果（表7）显示，与正常组对照相比，模型组小鼠肝组织中胱天蛋白酶3活性增加，是正常组对照的5.28倍（P＜0.01）。与模型组相比，PSSC 30和100 mg·kg-1组肝组织胱天蛋白酶3活性分别降低至68%和36%（P＜0.01）。

Tab.3 Effect of PSCC on content of malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH）and reactive oxygen species（ROS）in liver tissue of ALF mice

Tab.4 Effect of PSSC on activities of hepatic antioxidant enzymes of ALF mice

Tab.5 Effect of PSCC on serum content of inflammatory factors in ALF mice

Tab.6 Effect of PSSC on hepatic inflammation factors in ALF mice

Tab.7 Effect of PSSC on activity of hepatic caspase 3 in ALF mice

3 讨论

LPS和GalN的联合作用下，小鼠肝细胞在短时间内被大量破坏，肝功能迅速衰竭，ALF小鼠迅速死亡［13-14］，与本研究结果一致。本研究结果显示，PSSC明显延长了ALF模型小鼠的存活时间。提示PSSC对ALF诱导的小鼠死亡具有明显的缓解作用。

本研究结果还显示，PSSC可降低ALF模型小鼠血清GPT和GOT的活性及肝组织病理评分。肝细胞受损后，细胞内的转氨酶释放进入机体内环境，血清GPT和GOT水平可显示肝细胞的受损程度［15-17］。因此提示，PSSC能缓解ALF模型小鼠的肝细胞损伤。

肝氧化应激与LPS和GalN联合诱导的ALF紧密相关［18-21］。PSSC给药后，ALF模型小鼠肝和血清中GSH，SOD，GSH-Px和CAT的水平均显著增加，而MDA含量则明显下降。这些研究结果说明，PSSC可提高ALF小鼠肝组织抗氧化酶活性，增加抗氧化因子GSH含量，降低氧化应激标志物水平。不仅如此，PSSC还能明显降低肝组织ROS的相对含量。因此，缓解肝氧化应激在PSSC的肝保护活性中发挥了重要作用。

经PSSC处理后，ALF模型小鼠血清和肝组织中TNF-α，IL-1β和IL-6含量均明显降低。这些炎症因子可与肝细胞表面相关受体相结合，启动受体下游信号转导通路，破坏肝细胞功能，甚至诱导肝细胞死亡［22-23］，在LPS和GalN联合诱导ALF的过程中起到关键作用［24］。本研究结果提示，抑制炎症反应与PSSC的肝保护活性相关。

PSSC显著抑制了ALF模型小鼠肝组织中胱天蛋白酶3活性。在ALF发生的过程中，细胞凋亡扮演了重要的角色，胱天蛋白酶3是介导细胞凋亡的重要因子，LPS和GalN可能通过激活胱天蛋白酶3活性而导致肝细胞异常凋亡继而出现ALF［25-27］。本研究结果提示，抑制肝细胞凋亡在PSSC的肝保护活性中亦起到重要作用。

综上所述，PSSC对LPS和GalN联合诱导的小鼠ALF具有明显的缓解作用，可能与其降低ALF小鼠肝组织氧化应激、抑制炎症反应和阻止细胞凋亡相关。

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Protective effect of Salvia chinensis Benth.polysaccharides on lipopolysaccharide and D-galactosamine induced acute liver failure in mice

HUANG Xu,ZHANG Lang,HAO Ji,CHENG Zhuo,FENG Tian-hui,SHU Guang-wen
(Department of ChemicalBiology,Schoolof PharmaceuticalSciences,South-CentralUniversity for Nationalities,Wuhan 430074,China)

OBJECTIVETo explore the protective effectof polysaccharides from Salvia Chinensis Benth.(PSSC)on lipopolysaccharide(LPS)and D-galactosamine(GalN)-provoked mouse acute liver failure(ALF)and the possible molecular mechanism.METHODSKunming mice were randomly divided into four groups:normalcontrol,model,model+PSSC 30 and 100 mg·kg-1groups.PSCC was given once a day and for a week.To establish an ALF model,mice ofmodeland PSSC groups were ip injected with LPS 10μg·kg-1and GalN 700 mg·kg-1atthe end of PSSC treatment.The microscopic structure of the liver was detected by HE staining.Serum and hepatic biochemicalparameters ofglutamic-oxalacetic transaminase(GOT),glutamic-pyruvic transaminase(GPT),catalase(CAT),superoxide dismutase (SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),malondialdehyde(MDA),and glutathione(GSH)were detected by colorimetric methods.The relative content of hepatic reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA fluorescentprobes.Levels ofcytokines tumornecrosis factor-α(TNF-α),interleukin 1β(IL-1β) and IL-6 in the serum and liver were detected by ELISA.Activity of caspase 3 in liver homogenates was detected by aspase 3 activity assay kit.RESULTSCompared with normalcontrolgroup,in the liver ofmodelgroup,hepatocytes were arrayed in disorder,cytoplasm ofhepatocytes shrank,and boundaries between cells were fuzzy,the infiltration of a large number of inflammatory cells and tissue hemorrhage could be detected,pathologicalscores were elevated significantly(P＜0.01),levels of MDA and ROS in the liver of ALF modelmice were elevated to 2.2 and 4.3 times thatof the normalcontrol,respectively (P＜0.01),the level of GSH decreased to 51%(P＜0.01),and the activities of SOD,CAT and GSH-Px declined to 74%,36%and 42%,respectively(P＜0.01).Levels of TNF-α,IL-1βand IL-6 in the serum and liver ofmodelgroup were increased(P＜0.01),and caspase 3 activity was increased to 5.3 times that of the normal control(P＜0.01).Compared with the model group,the number of surviving mice in PSSC groups increased,liver pathologicalscores declined(P＜0.01),levels of MDA and ROS increased (P＜0.01),levels of GSH,TNF-α,IL-1βand IL-6 in the liver and serum declined(P＜0.01),and caspase 3 activity decreased(P＜0.01).CONCLUSIONPSSC is able to alleviate LPS and GalN-induced ALF in mice. Inhibition ofhepatic oxidative stress,inflammatory response,and cellapoptosis is possibly implicated in the protective effect of PSSC.

polysaccharides,Salvia chinensis;acute liverfailure;lipopolysaccharides;galactosamine

SHU Guang-wen,E-mail:shuguangwen@whu.edu.cn,Tel/Fax:(027)67841196

R265.5

：A

：1000-3002-（2017）04-0311-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.04.003

Foundation item:The project supported by Research Project of Higher Education from Hubei Provincial Department of Education(2015195)

2016-11-11接受日期：2017-04-01）

（本文编辑：贺云霞）

湖北省高等学校省级教学研究项目（2015195）

黄旭，男，化学生物学专业本科生；舒广文，男，理学博士，副教授，主要从事传统药物治疗肝疾病的物质基础与作用机制研究。

舒广文，E-mail：shuguangwen@whu.edu.cn，Tel/ Fax：（027）67841196