UPLC法测定整参·须根和芦头中人参皂苷的含量

2017-05-30赵琳琳赵云平魏静娜

安徽农业科学 2017年28期

关键词：须根

赵琳琳赵云平魏静娜

摘要 [目的]建立适用于整參、须根、芦头中人参皂苷的超高效液相色谱（UPLC）检测方法，同时测定人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量。[方法]采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）分离，流动相为乙腈-0.1 mol/L磷酸溶液，梯度洗脱，检测波长为203 nm，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min。[结果]人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、RC、Rb2、Rd线性关系良好，回收率在87.3%～98.6%。[结论]该方法准确、重复性好，适用于整参、须根、芦头中人参皂苷的定量分析。

关键词人参皂苷；超高效液相色谱法；整参；须根；芦头

中图分类号 S567.5+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0138-03

Abstract [Objective] The research aimed to establish a chromatographic separation method for the determination of ginsenosides in the whole ginseng， fibrous root and root refs.Ginsenosides Rg1，Re，Rf，Rg2，Rb1，Rc，Rb2 and Rd were determined.[Method]The separation was performed by a ACQUITY UPLC BEH C18 column （1.7 μm， 2.1 mm× 50 mm）， the mobile phase was acetonitrile -0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min， the detection wavelength was set at 203 nm， and the column temperature was 35 ℃. [Result]The method showed a good linear relationship of ginsenosides Rg1， Re， Rf， Rg2， Rb1， Rc， Rb2， Rd.Recovery rate was from 87.3% to 98.6%.[Conclusion]This method is accurate and good reproducibility，and suitable for the determination of ginsenosides in the whole ginseng， fibrous root and root refs.

Key words Ginsenosides； UPLC； Whole ginseng；Fibrous root；Root refs

人參（Panax ginseng C.A.Mey）为五加科植物人参的根，是我国珍贵中草药材[1-2]，主要功能有复脉固脱、补脾益肾、生津养血、安神益智。研究表明，人参具有抗肿瘤、神经系统活性、心脑血管系统活性、调节免疫系统等作用[3]。人参中有多种独特活性成分包括人参皂苷、人参挥发油、人参多糖、人参多肽等，其中人参皂苷含量的高低是考察人参质量的重要评价指标[4-5]。

人参皂苷可通过抑制癌细胞增殖、减少癌细胞侵袭和转移、影响癌细胞周期、诱导癌细胞自噬并促进细胞凋亡等方面发挥抑癌功效，国内外学者从分子水平上研究了人参皂苷及其衍生物抗结肠癌的作用机制，主要涉及到了线粒体通路、内质网应激以及WNT/β-catenin信号通路，通过抑制结肠癌细胞的生长，降低新生血管的生成，减少癌细胞的侵袭和迁移，最终诱导结肠细胞自噬和凋亡[6]。人参皂苷Rg1与Rb1作为人参益智作用的主要活性成分，可通过改变脑内主要神经递质的量、信号转导途径中蛋白分子等，改善动物的学习记忆行为能力[7]。张有为等[8]利用细胞计数法、流式细胞术和荧光染色法检测了27种人参皂苷和皂苷元对体外培养的人体骨肉瘤细胞U2OS的增殖、细胞周期和细胞死亡的影响，结果发现人参皂苷均有不同的抗U2OS活性，其中Rf活性最强。人参皂苷Rb1能够通过上调脂肪组织周脂素的表达，减少游离脂肪酸的释放和甘油三酯的异位沉积，这可能是其改善机体胰岛素抵抗和糖代谢异常的作用机制之一[9]。周玥等[10]利用Sca-1+HSC/HPC连续移植建立Sca-1+HSC/HPC小鼠衰老体内模型，研究人参皂苷Rg1延缓衰老的作用与相关衰老信号分子之间的关系，为人参皂苷Rg1抗衰老作用提供试验依据。通过上述文献报道可以看出，人参皂苷在现代医学疑难病的治疗中发挥的作用得到了深入的研究。

人参皂苷类成分分析多采用高效液相色谱串联紫外分光光度法、高效液相色谱串联质谱法、高效液相色谱串联蒸发光散射检测法、薄层色谱法、比色法等[11-14]，其中高效液相色谱串联二极管阵列检测器法因其准确度高、稳定性和重复性较好而得到广泛应用，但人参皂苷类成分结构差异在糖的位置、数量，极性非常相近难以达到很好的分离[15]，导致色谱分析时间需要80～100 min才能将其有效分离。笔者采用超高效液相色谱（UPLC）串联二极管阵列检测器，在保持较高分离度的前提下，将分离时间控制在35 min以内，建立了整参、须根、芦头中8种人参皂苷定量分析方法，为人参皂苷的合理开发提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试材参皂苷Rg1（批号R-015-130823，纯度≥98%），人参皂苷Re（批号R-020-131117，纯度≥98%），人参皂苷Rf（批号R-021-131217，纯度≥98%），人参皂苷Rg2（批号R-016-131228，纯度≥98%），人参皂苷Rb1（批号R-021-131122，纯度≥98%），人参皂苷Rc（批号R-008-131128，纯度≥98%），人参皂苷Rb2（批号R-013-131111，纯度≥98%），人参皂苷Rd（批号R-009-130826，纯度≥98%），均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；二氯甲烷（AR）、正丁醇（AR）均购自天津市风船化学试剂科技有限公司；磷酸（HPLC级）购自天津光复精细化工研究所；乙腈（HPLC级）购自Merck公司；水为超纯水。

1.2 仪器超高效液相色谱仪Waters Quatemary Solvent Manager；超声波清洗器为AS系列超声波清洗器，天津Autoscience仪器有限公司；电子分析天平METTLER AB54、METTLER XS205。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件。色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）：流动相为乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B）；梯度洗脱：0～4 min（19%A），4～11 min（19%A～25%A），11～33 min（25%A～33%A），33～34 min（33%A～19%A），34～40 min（19%A）；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；检测波长203 nm；进样量2 μL。

1.3.2 对照品溶液的配制。精密称取8种人参对照品，加甲醇溶解，配置浓度为人参皂苷Rg1 0.507 mg/mL、Re 0.508 mg/mL、Rf 0.407 mg/mL、Rg2 0.392 mg/mL、Rb1 0.867 mg/mL、Rc 0.351 mg/mL、Rb2 0.395 mg/mL、Rd 0.608 mg/mL的混合標准溶液。

1.3.3 供试品溶液制备。分别精密称取整参、须根、芦头粉末0.2 g（精确到±0.0001 g），置索式提取器中，加入二氯甲烷80 mL，加热回流3 h后，弃去二氯甲烷液，残渣挥干溶剂，连同滤纸移入锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇25 mL，密塞，浸泡4 h，超声30 min，滤过，用水饱和正丁醇少量多次冲洗滤纸，合并滤液和洗液，放置于蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇溶解转移至2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度摇匀，滤过，即得。

1.3.4 方法学考察。

1.3.4.1 系统适应性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液各2 μL，在“1.3.1”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱圖。

1.3.4.2 线性关系的考察。取“1.3.2”人参皂苷混合标准溶液50、100、150、200、250 μL于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，得到人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd系列标准混合溶液，以不同浓度为横坐标、不同浓度对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.3 精密度试验。精密吸取人参皂苷混合标准溶液2 μL，按照“1.3.1”操作步骤连续6次进样，测得8种人参皂苷的RSD。

1.3.4.4 稳定性试验。取同一供试品溶液，以“1.3.1”色谱条件，每次进样2 μL，分别在2、4、8、12、16、20、24 h进样，测定8种人参皂苷的RSD。

1.3.4.5 回收率试验。精密称取已知含量整参样品6份，每份0.1 g，加入对照品溶液，按照“1.3.3”制备供试品溶液，再按“1.3.1”色谱条件测定峰面积，计算平均回收率和RSD。

1.3.5 样品含量测定。分别取整参、须根、芦头2个批次样品，每个样品做6个平行，按照“1.3.3”方法制备供试品溶液，精密吸取2 μL，按“1.3.1”色谱条件进行测定，外标法计算样品中的平均含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适应性试验。从图1可以看出，Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的色谱峰与相邻的色谱峰的分离度均大于1.5，Rg1、Re也可以有效分离，说明此条件适合人参皂苷的测定。

2.1.2 线性关系的考察。按照“1.3.4.2”操作，得到8种人参皂苷标准混合溶液，以不同浓度为横坐标、不同浓度对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得出人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb、Rc、Rb2、Rd的线性回归方程分别为：Y=45 804x-32 340（r=0.999）、Y=38 838x-15 476（r=0.998）、Y=48 246x-15 729（r=0.997）、Y=40 851x-2 3731（r=0.996）、Y=32 643x+2 790（r=0.998）、Y=33 112x-12 734（r=0.996）、Y=31 943x-5 350（r=0.999）、Y=40 657x-1 2313（r=0.998），表明8种人参皂苷分别在0.254～1.266、0.254～12.270、0.204～1.018、0.196～0.980、0.434～2.168、0.176～0.878、0.198～0.988、0.304～1.520 μg/mL线性关系良好。

2.1.3 精密度试验。按照“1.3.4.3”操作，连续6次进样，测得人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的RSD分别为0.88%、0.97%、0.18%、2.19%、1.67%、0.20%、1.75%、0.88%，表明精密度良好。

2.1.4 稳定性试验。按照“1.3.4.4”操作，测定人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rd的RSD分别为2.06%、2.17%、2.74%、1.91%、2.83%、2.75%、1.98%、1.70%，表明样品在24 h内稳定。

2.1.5 回收率试验。从表1可以看出，8种人参皂苷回收率为87.3%～98.6%，RSD为1.04%～2.77%，表明该方法准确、可靠，符合相关要求。

2.2 样品含量测定从表2可以看出，整参、须根和芦头中Rf、Rg2和Rd的含量较低，整参和须根中Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2含量较高；芦头中Rg1、Re含量较高。不同样品中人参皂苷含量由高到低的顺序为须根、整参、芦头。

3 结论与讨论

在样品提取过程中，先尝试了水饱和正丁醇直接提取和水提后利用D101大孔树脂净化，前者进样后杂质较多，分离度较差，后者回收率较低。故笔者在水饱和正丁醇提取之前比较了乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷脱脂，乙酸乙酯脱脂效果不佳，二氯甲烷与三氯甲烷脱脂后，样品峰可以有效分离，但三氯甲烷毒性较大，该试验采用二氯甲烷来进行脱脂；同时又比较了水饱和正丁醇浸泡时间，分别为1、2、4、8、16、24 h，人参总皂苷浸泡4～16 h含量变化不大，故采用浸泡4 h。该研究最终采用方法为二氯甲烷脱脂后，水饱和正丁醇浸泡4 h超声处理，进样杂质峰干扰较少，分离度较好。

流动相的选择比较了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液。乙腈-0.1%甲酸溶液不能有效分离并且基线波动较明显；乙腈-水色谱峰可以分离，但是人参皂苷Rg1与Re极性相似，出峰时间接近，2个峰不能完全有效分离。该研究采用乙腈-0.1%磷酸溶液，乙腈在4～11 min，比例从19%逐渐变化到25%的过程中，Rg1与Re可有效分离。

试验结果表明，整参、须根和芦头中Rf、Rg2和Rd的含量较低，整参和须根中Rg、Re、Rb1、Rc、Rb2含量较高；芦头中Rg1、Re含量较高。虽然人参须不作为主要的用药部位，但是因其人参皂苷含量较高，可以考虑特殊用药情况下人参须代替人参作为用药部位。该试验结果为人参皂苷的提取与用药提供参考依据，因试验样品数量有限，为了进一步的统筹分析，还需增加样品数量进行数据累积。通过试验中UPLC方法优化缩短了进样分析时间，增加方法准确性，并且方法稳定性好，回收率较高，适用于人参皂苷类物质的定量分析。

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