辣木组织培养技术初步研究

2017-05-30陆滟灵安冰

安徽农业科学 2017年33期

陆滟灵　安冰

摘要[目的]初步研究辣木组织培养技术。[方法]以辣木种子为外植体，通过组织培养诱导不定芽，形成完整的组培再生植株，并研究辣木诱导、增殖和生根的适宜培养基和培养条件。[结果]最佳外植体诱导培养基为1/2MS+6-BA0.80 mg/L + NAA0.40 mg/L+益培灵0.10 g/L，萌芽率为95%；最佳增殖培养基为MS+6-BA0.30 mg/L+NAA0.02 mg/L+益培灵0.05 g/L，增殖个数为6.4个；最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.30 mg/L+ABT1号 0.015 mg/L+益培灵0.03 g/L，生根率可达95%，根长为5.21 cm。[结论]辣木组培快繁技术有助于解决良种缺乏的问题，并为种质资源开发利用提供技术支撑。

关键词辣木；外植体；组织培养

中图分类号S792.99文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0140-02

Preliminary Study of Tissue Culture Technology of Moringa oleifera Lam.

LU Yanling ， AN Bing*

（Guangxi Paiyangshan State Forest Farm，Ningming，Guangxi 532500）

Abstract[Objective]To preliminarily study the tissue culture technology of Moringa oleifera Lam..[Method]Seeds of M. oleifera Lam. were used as explants to induce adventitious buds and form a complete tissue culture plant by tissue culture technology.The suitable medium and culture condition for induction， multiplication and rooting of M. oleifera Lam. were studied.[Result]The most suitable culture combination for explants induction was 1/2MS+6-BA0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L+Yipeiling 0.10 g/L，the germination rate was 95%.The best culture combination for multiplication was MS+6-BA0.30 mg/L+NAA0.02 mg/L+Yipeiling 0.05 g/L，the number of multiplication was 6.4. The best rooting medium was 1/2MS+IBA0.30 mg/L+ABT1 0.015 mg/L+Yipeiling 0.03 g/L，the rooting rate could reach 95% and the root length was 5.21 cm.[Conclusion]Rapid propagation technology of M. oleifera Lam. can help to solve the lack of seeds and provide technical support for development and utilization of germplasm resources.

Key wordsMoringa oleifera Lam.； Explant； Tissue culture

辣木（Moringa oleifera Lam.）又称鼓槌树（Drumstick tree），原产于印度北部，是多年生热带落叶乔木，其适应力强，耐干旱、贫瘠和病虫害，能适应砂土、黏土和微碱性土壤，被誉为“奇迹之树”[1-2]。辣木叶片、种子、果荚、根系、茎杆和幼苗均可食用，营养丰富而全面，是目前已发现的最好的植物蛋白、叶酸、泛酸、钙铁硒等多种营养来源，含多种矿物质和维生素，可作为蔬菜食用，也可广泛应用于医药、保健等领域[3]，美国Discovery频道曾在“另类医学指南”系列报道中指出辣木含有丰富的营养素，被广泛应用于改善各种疾病，成效显著。

目前辣木繁殖方式以播种为主，扦插为辅，但仅依靠播種和扦插，种质混杂，质量参差不齐，不能满足优良品系大规模产业需求[4]。辣木组培快繁技术有助于解决良种缺乏的问题，并为种质资源开发利用提供技术支撑。

组培由于条件可控，不受季节限制可全年生产，利用组培技术，可实现优良无性系或单株迅速推广，不改变其遗传性，保持原有优良性状不变。通过组织培养技术有望建立“种质银行”或“基因库”，便于种植保存和交流，加速优良品种的推广，缩短育种周期，获得常规育种难以或无法得到的新基因型，创造新的物种或品种。辣木组培可保持单株优良特性，达到优良遗传材料的快速繁殖（良种快繁）、脱毒良种苗和无病毒苗的大量繁殖、特殊育种材料的快速繁殖、基因工程植株的快速繁殖和离体种子的快速繁殖等[5]。该试验通过组织培养手段，以印度辣木种子为材料，对外植体诱导及无菌组织培养体系进行尝试，初步建立无菌组培体系，并获得辣木诱导、增殖和生根的适宜培养基和培养条件。

1材料与方法

1.1材料以辣木种子为材料，原产地为印度。

1.2方法

1.2.1外植体的取材与灭菌。选择饱满无皱缩的辣木种子作为外植体，去除纸质白翼，材料用饱和洗衣粉溶液刷洗干净后备用。外植体灭菌采用2个处理：M1为75%乙醇30 s+1‰氯化汞10 min；M2为15%新洁尔灭30 min+15%次氯酸钠15 min，统计不同处理的污染率、灼伤率、萌芽率。

1.2.2辣木组织培养体系的建立。

1.2.2.1外植体诱导培养。将灭菌后的材料接种到培养基上，至于光强3 000 lx、温度25 ℃诱导不定芽，外植体诱导培养基采用4个处理，Y1为MS+6-BA0.80 mg/L+NAA 0.40 mg/L+益培灵0.10 g/L；Y2为MS+6-BA1.00 mg/L+NAA0.50 mg/L+益培灵0.10 g/L；Y3 为1/2MS+6-BA 0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L+益培灵0.10 g/L；Y4为1/2MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA0.50 mg/L+益培灵0.10 g/L，统计不同处理的保存率、萌芽数、萌芽率。

1.2.2.2增殖培養。增殖培养基采用3个处理：Z1为MS+6-BA0.70 mg/L+NAA0.06 mg/L+益培灵0.05 g/L；Z2为MS+6-BA0.50 mg/L+NAA0.04 mg/L+益培灵0.05 g/L；Z3 为MS+6-BA0.30 mg/L+NAA0.02 mg/L+益培灵0.05 g/L。培养条件：温度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光强2 500～3 000 lx，统计不同处理的增殖个数、茎芽长度。

1.2.2.3生根培养。生根培养基采用3个处理：S1为 1/2MS+IBA0.40 mg/L+ABT1号 0.020 mg/L+益培灵0.03 g/L；S2为1/2MS+IBA0.30 mg/L+ABT1号0.015 mg/L+益培灵0.03 g/L；S3为1/2MS+IBA0.20 mg/L+ABT1号0010 mg/L+益培灵0.03 g/L。培养条件：温度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光强3 000～3 500 lx，统计不同处理的苗高、根长、生根率。

以上所有培养基均加入30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂。培养基中所使用的益培灵，是一种新型组织培养专用防污染杀菌剂，其作用机理是穿透微生物的细胞壁进入细胞内部，与核酸碱基结合，干扰复制或通过断开微生物关键蛋白质的键而起杀菌作用，购自上海稼丰园艺用品有限公司。

2结果与分析

2.1外植体的取材与灭菌

由表1可知，处理M1比处理M2污染率低22百分点、萌芽率高27百分点、灼伤率低14百分点，灭菌后的外植体生长良好、萌发正常，有明显优势，但有褐化现象。这说明75%乙醇+1‰氯化汞可以有效降低外植体的污染率，但对外植体有一定伤害作用，易出现褐化，因此无菌水清洗时，一定要清洗彻底。如果褐化情况严重，可以尝试在1‰氯化汞灭菌时，将10 min灭菌过程分为2次5 min灭菌，中间用无菌水清洗数次，这样对褐化、灼伤现象有较明显的抑制作用，且对灭菌效果影响不大。

2.2辣木组织培养体系的建立

2.2.1外植体诱导培养。由表2可知，诱导培养基的激素溶度配比以处理Y3效果最佳，萌芽率高，生长快且芽长势良好。在保存率相差不大的情况下，处理Y1、Y2和Y4的萌芽率较Y3分别低28百分点、20百分点和14百分点，说明在基础培养基相同的情况下，激素配比6-BA0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L更为适宜；在相同激素配比下，1/2MS较MS更适宜；最佳培养基配比为1/2MS+6-BA0.80 mg/L+NAA0.40 mg/L+益培灵0.10 g/L。当激素浓度过高时，辣木容易出现大团愈伤组织，不易萌芽，且出现玻璃化现象，即使萌芽较多，也容易成为无效芽。

2.2.2增殖培养。由表3可知，增殖培养基以处理Z3效果最佳，增殖个数为6.4个，茎芽可伸长7.8 cm，芽生长旺盛，茎粗壮，叶片展开良好；处理Z1激素浓度偏高，增殖个数较处理Z3低51.6%，茎芽伸长低42.3%，生长较弱，基部易形成愈伤团块，芽点密集但不易伸长，且出现黄叶或落叶；处理Z2激素浓度稍好，增殖个数较处理Z3低20.3%，茎芽伸长低20.5%，茎叶细长，长势较弱。

2.2.3生根培养。由表4可知，以处理S2生根效果最佳，接种25 d后，辣木苗根系发达，根长5.21 cm，苗木生长旺盛，移栽后成活率可达95%；处理S1激素浓度过高，苗高和根长分别较处理S2低29.2%和32.5%，生根率低，且根基部出现膨大或褐化现象，苗木生长缓慢细弱，部分苗木不生根，长势弱，移栽后成活率低；处理S3激素浓度偏低，苗高和根长分别较处理S2低18.4%和23.2%，生根率较低，根系较弱，移栽后成活率不高，抗性差。

3结论与讨论

该研究结果表明，辣木种子使用乙醇和氯化汞灭菌1次的效果最好，但容易灼伤种子，引起褐化，降低发芽率。新洁尔灭和次氯酸钠污染率次之，基本无灼伤，但污染率高，这与类似研究得出的结果相一致[6]。在实际操作时，辣木种子比较轻，容易漂浮起来，灭菌不彻底，可以用纱布包起来灭菌，灭菌过程结束后，晾干再接种。不同浓度激素对外植体诱导有显著影响，处理Y3为最佳培养基配比，接种4～6 d时开始萌动，下胚轴基部有白色疏松的愈伤组织，8 d左右出现绿色凸起，10～12 d诱导出不定芽。从试验中发现，激素浓度过高，愈伤组织易膨大、畸形并难诱导出芽；激素浓度过低，又影响芽的萌动。试验结果表明，在诱导阶段，1/2MS作为基础培养基，明显优于MS培养基，说明在一定浓度范围内，辣木对培养基的吸收利用量是一定的，浓度过高反而会抑制苗木的生长。当辣木茎段进行初代培养诱导出的芽伸长至 3～5 cm时，将其切下接种在辣木增殖培养基中，定期观察其增殖情况。培养时，要注意掌握好暗培养、弱光培养及自然光培养的时间，才能够获得生长健壮、增殖个数适宜的芽，建立有效的无菌芽繁殖体系。增殖培养基中，激素6-BA和NAA的浓度配比非常重要，直接影响着增殖个数和有效芽的质量。在生根培养试验中，处理S2为最佳配方，接种6 d后芽基部开始形成根原基凸起，8～10 d出现小根，15～20 d长出茁壮的根系。由于组培苗是在无菌、恒温等人工控制的环境下生长，因此炼苗过程非常重要。

基础培养基有效保证了辣木的生存和生理活动所需的基本营养物质及能量，在适当植物生长调节剂配比下，诱导细胞分裂分化，愈伤组织进一步发育成根茎叶，形成完整的植株，也正是组织培养的难点所在，除此之外，在培养时，还要注意温度、湿度和光照等培养条件，寻找最佳的培育条件，从而建立高效的无菌組培体系[7-8]。在植物组培快繁过程中，培养基、接种器具、超净工作台、接种室灭菌不规范等均可导致污染的发生，而植物本身在茎叶表面容易滋生大量的微生物，甚至一些菌丝体侵入表皮的薄壁组织，不能被一般的表面灭菌方法所清除，随着材料带入培养过程，引起内生菌污染[9]。该试验采用了益培灵这种新型组织培养专用防污染杀菌剂，可有效减轻微生物污染，提高成活率和成功率[10]。在后续试验中，使用和筛选新型组织培养专用防污染杀菌剂，对减轻微生物造成的污染，提高培养成功率和培养物的成活率，降低生产成本，提高经济效益等都有重要意义。目前世界上还有很多辣木资源未被合理利用，可以收集不同辣木品系，建立辣木种质资源体系，加速优良无性系的选育推广[11]。

参考文献

[1]

张燕平，段琼芬，苏建荣.辣木的开发与利用[J].热带农业科学，2004，24（4）：42-48.

[2] 刘昌芬，李国华.辣木的研究现状及其开发前景[J].云南热作科技，2002，25（3）：20-24.

[3] 刘昌芬，李国华.辣木的营养价值[J].热带农业科技，2004，27（1）：4-7.

[4] 杨春梅，屈云慧，汪国鲜，等.辣木组织培育和快繁技术研究[J].西南农业学报，2015，28（5）：2218-2221.

[5] 罗云霞.辣木组织培养繁殖技术研究[D].昆明：西南林学院，2007：1-64.

[6] 张婧.辣木组织培养及有效成分分析[D].福州：福建林业大学，2013：1-64.

[7] 潘瑞炽.植物生长调节剂原理与应用[M].广州：广东高等教育出版社，2003.

[8] 杨增海.园艺植物组织培养[M].北京：化学工业出版社，2003：15.

[9] 李晓燕.抑菌剂抑菌能力比较及其对组培苗生长发育的影响[D].大连：辽宁师范大学，2010：1-74.

[10] 施隆文，汪霞，卢佳.“益培灵”的抑菌效果及对大花蕙兰类原球茎增殖与分化的影响[J].北方园艺，2012（4）：123-125.