王文正　李腾　李霞

摘要[目的]研究泰山赤灵芝中灵芝酸的检测方法并应用该方法测定灵芝酸A的含量。[方法]利用反相高效液相色谱和电喷雾质谱联用技术，通过研究已知的灵芝酸化合物的相对分子质量及结构特征，鉴定泰山赤灵芝中生物碱提取物中的灵芝酸类化合物，并通过灵芝酸A标准品的标准曲线测定其中灵芝酸A的含量。[结果]在泰山赤灵芝样本中检测到灵芝酸A、A1、B、C1、R、beta、delta、epsilon、gamma、zeta，灵芝酸A的含量为115.4 μg/g。[结论]泰山赤灵芝含有较高的灵芝酸，液质联用仪对泰山赤灵芝天然产物结构的分析以及含量测定准确可靠。

关键词泰山赤灵芝；灵芝酸；灵芝酸A；液质联用仪；含量测定

中图分类号S567.3+1文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0123-03

Measure of Ganoderma Lucidum Acid and Ganoderma Lucidum Acid A in Taishan Ganoderma Lucidum

WANG Wenzheng，LI Teng，LI Xia*

（Institute of Quality Standard， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan，Shandong 250100）

Abstract[Objective] The research aimed to study detection method of ganoderma lucidum acid in Taishan Ganoderma lucidum and application of the method for determining the content of ganoderma lucidum acid A.[Method]Using reversedphase high performance liquid chromatography （HPLC） and electrospray ionization mass spectrometry technology， through the study of ganoderma lucidum acid known compounds and the relative molecular mass of the structure characteristics， identification of ganoderma lucidum acid compounds of Taishan Ganoderma lucidum alkaloids in the extracts， and to determining the content of ganoderma lucidum acid A through the standard curve of the standard of ganoderma lucidum acid A.[Result]We detected ganoderma lucidum acid A， A1， B， C1， R， beta， delta， epsilon， gamma， zeta in Taishan Ganoderma lucidum samples， ganoderma lucidum acid A content of 115.4 μg/g.[Conclusion]It contents high level ganoderma lucidum acid in Taishan Ganoderma lucidum， liquid chromatograph/mass spectrometer（LC/MS） of Taishan Ganoderma lucidum natural product structure analysis and content determination is accurate and reliable.

Key wordsTaishan Ganoderma lucidum；Ganoderma lucidum acid；Ganoderma lucidum acid A；Liquid mass combination；Content determination

靈芝为《中华人民共和国药典》收载的常用中药。赤灵芝作为中药灵芝的主流品种，具有提高机体免疫功能、改善血液循环、提高心脑供血供氧能力、提高细胞和组织生理功能以及安神、解惊、解毒等功效[1-3]。灵芝有效成分包括灵芝多糖、灵芝酸、腺苷、赤芝孢子内酯A、赤芝孢子酸A、灵芝碱甲、灵芝碱乙、油酸、灵芝总碱、薄醇醚、灵芝纤维素等。灵芝中的很多三萜类化合物即灵芝酸具有生理活性，如ganoderic acid A、B、C和D能够抑制小鼠肌肉细胞组胺的释放，ganoderic acid F有很强的抑制血管紧张素酶的活性，赤芝孢子酸A对CCl4和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氮酶升高均有降低作用，赤芝孢子内酯A具有降低胆固醇作用[4-5]。因此对灵芝酸的进一步深入研究将有利于灵芝有效成分的寻找和进一步阐明其生理活性。

一般用于药物化学成分的研究技术包括红外、紫外、质谱和核磁共振等。近年来，由于高效液相色谱与质谱联用（LC/MS）技术的出现，LC/MS已成为现代分析手段中必不可少的组成部分。液质联用技术将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点相结合，组成了较完美的现代分析技术。在药物的含量测定、药物动力学研究的代谢物分析等试验中成为重要的分析手段[6-10]。该试验借助LC/MS技术进一步对泰山赤灵芝的有效成分进行分析，并测定其中灵芝酸A的含量。

1材料与方法

1.1仪器与试剂

美国Waters Alliance 2695 HPLC，ZQ电喷雾质谱仪，索氏提取器。甲醇为色谱纯，无水乙醇为分析纯，水为双蒸水，泰山赤灵芝、标准品灵芝酸A由泰山赤灵芝开发公司提供。

1.2试验方法

1.2.1标准品储备液的制备。精密称取标准品，用甲醇配制成1.5 g/L的标准溶液，冷藏备用。

1.2.2供试品溶液的制备。均匀称取泰山赤灵芝样品粉末（过40目筛）40.3 g，于索氏提取器中，以400 mL无水乙醇提取24 h，得提取液286 mL，以0.22 μm微孔滤膜过滤，作为供試液。

1.3试验条件

1.3.1色谱条件。采用Waters Symmetry shield RP18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；进样体积10 μL；流动相由甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）组成，流速0.2 mL/min；梯度洗脱程序为：0～20 min甲醇由5%线性增至100%（体积百分数）；20～25 min用100%甲醇洗脱。

1.3.2电喷雾（ESI）条件。离子源温度120 ℃，脱溶剂温度200 ℃，毛细管电压3.0 kV，锥孔电压60 V，萃取电压2.5 V，聚焦透镜电压0.5 V，椎孔气体流速42 L/h，脱溶剂流速311 L/h。

1.3.3质谱（MS）分析条件。检测负离子（ES-），离子电压1.0 V，光电倍增器电压650 V，分析室真空度2.6e-5。

1.3.4紫外检测。在质谱检测的同时，采用二极管阵列（PDA）220～350 nm紫外检测器分析样品，进行紫外检测。

1.4标准曲线取“1.2.1”标准品灵芝酸A储备液，用甲醇逐级稀释，配制成灵芝酸A标准系列使用液，灵芝酸A的浓度分别为0、7.5、15.0、30.0、75.0、150.0 μg/mL。由标准品的浓度和其相应峰面积绘制标准曲线。

2结果与分析

2.1不同种类灵芝酸的测定

根据灵芝酸的基本结构图（图1），得出目前主要的灵芝酸化合物中R1、R2、R3、R4不同取代基的官能团结构以及各种灵芝酸活性成分的化学式、分子量（表1）。

泰山赤灵芝粉末处理后的供试液，用液质联用仪测定，

得到灵芝酸的选择离子图（图 2）。根据表1中已知的灵芝

酸分子量和图2可知，由分子量553.70构建的离子选择图谱可知泰山赤灵芝中含有一定量的灵芝酸R；由分子量517.70构建的离子选择图谱可知泰山赤灵芝中含有一定量的灵芝酸A1；由分子量515.67构建的离子选择图谱可知泰山赤灵芝中含有一定量的灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸 delta、灵芝酸gamma、灵芝酸epsilon；由分子量513.70构建的离子选择图谱可知泰山赤灵芝中含有一定量的灵芝酸C1、灵芝酸zeta、灵芝酸 beta。

2.2灵芝酸A含量的测定

由标准品的浓度和其相应峰面积得到标准曲线方程为y=48 233x+218 717（R2=0.998 9），说明峰面积与灵芝酸A标准品线性关系良好（图3）。将样品测定灵芝酸A的峰面积（图4）带入标准曲线，得样品中灵芝酸A的含量为115.4 μg/g。并做加标回收试验得出，加标回收率在97.16%～102.44%。

3结论

利用反相高效液相色谱和电喷雾质谱联用技术，通过研究已知的灵芝酸化合物的相对分子质量及结构特征，鉴定泰山赤灵芝中生物碱提取物中的灵芝酸类化合物，并通过灵芝酸A标准品的标准曲线测定其中灵芝酸A的含量。结果发现，标准曲线的相关系数为0.998 9，峰面积与灵芝酸A标准

品线性关系良好，加标回收率在97.16%～102.44%，样品中

灵芝酸A的含量为115.4 μg/g。表明该方法用于泰山赤灵芝中灵芝酸A的测定准确、可靠。相对于其他分析技术，液质联用技术是一种快速灵敏的分析技术，准确性和回收率更高[11-12]。下一步将利用其优势，进一步分析泰山赤灵芝的活性成分，研究并发现其他活性成分。

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