杨水莲　聂健　莫美华　崔淑莲　李岩　邓华明

摘要[目的]明确不同出菇处理方法对巨大口蘑菌丝体相关酶活性的影响。[方法]以巨大口蘑菌丝体为试验材料，研究几种不同出菇处理方法对其在不同时间内3种酶活性的影响。[结果]能形成原基的3个处理组从菌丝恢复期到原基形成、现蕾阶段，酪氨酸酶活性相对比较稳定，不能形成原基的2个处理组酪氨酸酶先上升后下降，在第9天达到最大值，显著高于其他3个处理组，说明酪氨酸酶过高反而抑制了原基形成；蛋白酶、淀粉酶活性在原基形成前都得到有效的激活作用，酶活性显著高于不能形成原基的2个处理组。[结论]试验结果为实现巨大口蘑从传统的袋子覆土栽培向瓶子无土栽培出菇的转变，了解巨大口蘑形成原基的相关机理提供了理论依据。

关键词巨大口蘑；菌丝；原基形成；酶活性

中图分类号S646文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0012-03

Effect of Different Mushroom Treatment Methods on Correlation Enzyme Activity of Giant Mushroom Mycelium

YANG Shuilian1， NIE Jian1， MO Meihua2 et al

（1.Lingnan Institute of Technology， Guangzhou， Guangdong 510663；2.South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract[Objective] The aim was to clear effect of different mushroom treatment methods on correlation enzyme activity of giant mushroom mycelium. [Method] The giant mushroom was taken as tested materials， and the effect of different mushroom treatment methods on activity of three kinds of enzymes of its mycelium was studied. [Result] The tyrosinase activity of three treatments which could form primordium was relatively stable from the mycelial recovery period to primordium formation and budding stage；the tyrosinase activity of two treatments which could not form primordium firstly increased and then decreased， reached the maximum value on the 9th day， and was significantly higher than that of the other three treatments， which indicated that the higher tyrosinase could inhibit primordium formation. The activities of protease and amylase could be activated effectively before primordium formation， and was significantly higher than that of the other two treatments which could not form primordium. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the transformation of giant mushroom from traditional bag soilcover culture to bottle soilless culture and understanding the relevant mechanism of primordium formation of giant mushroom.

Key wordsGiant mushroom；Mycelium；Primordium formation；Enzyme activity

巨大口蘑（Tricholoma giganteum）屬于担子菌亚门层菌纲伞菌目口蘑科口蘑属，又名大白口蘑、洛巴伊口蘑，商品名有金鞭口蘑、金福菇等，是一种珍稀的食药用大型真菌[1]。多年来，巨大口蘑的生产方式都是覆土出菇[2-3]。笔者在此基础上，参考杏鲍菇等食用菌的栽培方法[4]，用瓶子装料接种，即待菌丝长满瓶子并出现生理黄水后，搔菌，然后往瓶子内注水，再把瓶子在适宜环境条件下倒扣放置培养7 d便能形成原基。而在实际生产过程中，用瓶子无土栽培巨大口蘑出现了出菇不整齐、出菇时间长等问题。食用菌原基的形成是出菇的基础，而原基的形成除了基本营养和适合的环境条件外，还与相关酶活性的大小密切相关[5]。这些酶大多是诱导酶，它们的活性在时间上的表达顺序与协同作用是食用菌内源生化代谢的重要内容。通过在基质中添加一些有利于这些酶合成或表达的物质，促进诱导，加快代谢，提高酶活性的表达水平，或者通过在基质中添加一些抑制剂，降低酶活性的表达，控制子实体的发生，提高产量，从生长代谢角度上研究子实体发生与发育[6-8]。通过不同的出菇处理方法，研究巨大口蘑从菌丝长满后到子实体形成阶段的菌丝酶活性，找出与原基的形成有关的酶，对于了解巨大口蘑在覆土栽培与无土栽培过程中各阶段的营养需要，确定其利用规律具有重要的指导意义。为此，笔者研究了不同出菇处理方法对巨大口蘑菌丝体相关酶活性的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌种。巨大口蘑。

1.1.2试剂。磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、L-酪氨酸、三氯醋酸、酪蛋白、福林试剂、盐酸、3，5-二硝基水杨酸、淀粉、麦芽糖。

1.1.3主要仪器。生化培养箱、高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、微量移液器。

1.2方法

1.2.1菌丝培养和出菇处理。

待菌丝长满袋子并出现生理黄水后，打开袋子，覆上一层厚3 cm的菜园土[9]。同时，待菌丝长满瓶子并出现生理黄水后，开盖搔菌，再往瓶子内注水，然后分别把瓶子倒扣处理和正放处理。此后每天以相同的方式对几种不同出菇处理方法进行管理，并保持菇房的温度为28～30 ℃，湿度为85%～95%[10]。

1.2.2酪氨酸酶活性测定。

参照魏要武等[11]的方法，并加以修改。取1 g新鲜菌丝的培养料，放入研钵中，加入5.00 mL 预冷的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8），冰浴研磨成匀浆，4 ℃、5 000 r/min离心20 min，上清液作为酶提取液。在比色皿中分别加入3.95 mL含1 mmol/L L-酪氨酸的磷酸盐缓冲液（pH 6.8），然后加入0.05 mL酶液并迅速混匀，立即用紫外可见分光光度計在317 nm波长处测定吸光值的变化，连续测定10 min。以吸光率增加的最初直线段斜率来计算酶活力。酶活力单位（U）定义为：测定条件（20 ℃）下1 min引起OD值变化0.1为1个酶活力单位。

1.2.3蛋白酶活性测定。

取1 g新鲜菌丝的培养料，放入研钵中，加入5 mL 0.02 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.4），充分磨匀后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液即为菌丝的粗酶液。蛋白酶活力的测定按黄卓烈[12]的方法。规定：在一定的反应条件下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。

1.2.4淀粉酶活性测定。

取1 g新鲜菌丝的培养料，放入研钵中，加入5 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8），充分磨匀后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液即为菌丝的粗酶液。酶活力的测定按黄卓烈[12]的方法。规定：在一定的反应条件下，淀粉酶1 min催化淀粉水解生成1 μmol麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位。

1.3数据分析

采用DPSv 9.50数理统计软件对数据进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同出菇处理方法对巨大口蘑菌丝体内酪氨酸酶的影响

由图1可知，5种不同处理的菌丝体内酪氨酸酶活性都呈先上升后下降的趋势，覆土、瓶子搔菌后正放1和倒扣1的酪氨酸酶活性在整个过程都比较低，而瓶子搔菌后正放2和倒扣2的酪氨酸酶活性在第6天后急剧上升，在第9天出现最高峰，分别达55.663 3和88.280 3 U/g，之后下降。第18天5种不同处理的菌丝体内酪氨酸酶活性接近。

2.2不同出菇处理方法对巨大口蘑菌丝体内蛋白酶的影响

由图2可知，覆土处理、瓶子搔菌后正放1和倒扣1的蛋白酶活性不断上升，在第21天（现蕾期）达到最大值，分别为582.075 0、664.697 5和677.579 3 U/g，显著高于正放2和倒扣2的蛋白酶活性。正放2和倒扣2的蛋白酶活性未被有效激活，整个过程蛋白酶活性变化不明显，一直处于较低水平。

2.3不同出菇处理方法对巨大口蘑菌丝体内淀粉酶的影响

由图3可知，第0～9天5种不同处理方法的淀粉酶活性差异不显著，均处于较低水平。第9天起，覆土处理、正放1和倒扣1的淀粉酶活性快速上升，显著高于其他2组处理。正放2和倒扣2在后期淀粉酶活性有所上升，但变化不明显。

图2不同出菇处理方法对巨大口蘑菌丝体内蛋白酶活性的影响

Fig.2Effect of different mushroom treatment methods on protease activity of giant mushroom mycelium

3结论与讨论

试验通过对巨大口蘑覆土后和瓶子搔菌后不同处理其菌丝体内3种酶活性的变化规律进行了研究，发现3种酶在不同阶段活性变化具有显著差异。覆土处理、瓶子搔菌后正放1和倒扣1在第18天均能形成原基，在第21天均能长出小菇蕾，而瓶子搔菌后正放2和倒扣2在测定的整个过程中未能形成原基。由此可见，巨大口蘑从菌丝恢复期到原基形成、现蕾阶段，不需要很高的酪氨酸酶活性，较高的酪氨酸酶活性抑制了菌丝扭结形成原基；而蛋白酶、淀粉酶活性在原基形成前都需要得到有效的激活作用，酶活性显著高于不能形成原基的处理组。

酪氨酸酶是一类广泛存在于植物体中含 Cu 的结合酶，一起参与呼吸末端氧化还原反应[13]。该研究发现，能形成原基的处理组在第6天酪氨酸酶活性有所升高，之后趋于平缓，与不能形成原基的处理组相比处于较低水平，可能是这个过程菌丝体内产生了酪氨酸酶的有效抑制剂[14]。而瓶子搔菌后正放2和倒扣2的酪氨酸酶活性呈现先上升后下降的过程，在第9天达到最高峰，显著高于其他3个处理。可能是因为菌丝体的呼吸作用受阻，激发了酪氨酸酶的活性，酶活性很高，菌丝营养生长没有结束，不能扭结形成原基，未具备产实的内在条件，即使有合适的外界环境，也不能出菇。具体原因还有待进一步研究。

该研究结果显示，能形成原基的处理组蛋白酶活性都呈现不断上升的趋势，与前人的描述一致[15]。蛋白酶活性的升高为新物质的合成积累氮源，当积累到一定程度时，诱导原基发生。而不能形成原基的处理组蛋白酶活性无明显变化，一直处于较低水平，说明该处理缺乏诱导蛋白酶应答反应的条件，缺乏物质的转换和积累，菌丝徒长，一直维持在营养生长阶段，因而难以形成原基，这与张乐[16]的研究结果一致。

研究表明，淀粉酶在食用菌菌丝生长阶段高，在子实体期降低[17]，说明在栽培前期大部分淀粉类物质被分解利用，在栽培后期则利用较少。该研究发现，5种处理的淀粉酶在前期阶段活性较低，从第9天起能形成原基的处理组淀粉酶活性快速上升。这可能是因为培养料中的不需要用到淀粉酶起分解作用的小分子物质在菌丝恢复期营养生长阶段被消化完后，需要进一步分解淀粉类大分子物质以满足菌丝体不断成长、扭结和形成原基的营养需求。而瓶子搔菌后正放2和倒扣2淀粉酶活性在整个阶段变化不明显，推测其在第21天未能形成原基可能与淀粉酶活性较低有密切关系。而赵亚东[17]对秀珍菇胞外酶的研究表明，胞外淀粉酶活性的高低与秀珍菇现蕾的早晚不相关。

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