毛智斌，赵凯科，江青东，郑 立，刘太宇,*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450000；2.河南牧业经济学院，河南郑州 450011)



葎草黄酮对牛乳腺上皮细胞相关基因表达的影响

毛智斌1，赵凯科1，江青东2，郑 立2，刘太宇1,2*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450000；2.河南牧业经济学院，河南郑州 450011)

以奶牛乳腺上皮细胞为细胞模型，用MTT法检测细胞的存活和生长情况，用不同浓度的黄酮溶液 (0、100、200、400、600、800 mg/L)刺激奶牛乳腺上皮细胞12 h，再用相同浓度的黄酮溶液(400 mg/L)作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间(1、4、9、12、16、24 h)，分别提取细胞总RNA，用荧光定量PCR法测定GHR、β-CN、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ泌乳相关基因的表达，研究葎草提取物总黄酮对乳腺上皮泌乳及炎性相关因子表达的影响。结果表明，试验组与空白组相比，奶牛乳腺上皮细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平降低(P<0.05)；生长激素受体(GHR)、β-酪蛋白(β-CN)的表达量高于对照组(P<0.05)。说明葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-CN和GHR的表达量，以浓度为400 mg/L培养4 h～12 h的效果最佳。 关键词：葎草；总黄酮；奶牛；乳腺上皮细胞；基因表达

雌性哺乳动物的乳腺能够充分发育并具备泌乳的功能。哺乳动物的乳腺随年龄阶段、发情周期和生理状态等的不同而发生周期性变化。在动物成年后，乳腺需经历增殖、分化和凋亡。乳腺的发育和泌乳主要受机体内相关激素的影响，主要有雌二醇(E2)、孕酮(P4)、生长激素(GH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和催乳素(PRL)。其中生长激素(GH)和催乳素(PLR)对乳腺的生长发育起重要的作用。催乳素(PRL)对启动泌乳起着关键作用，同时腺垂体不断地分泌PRL才能够保证维持泌乳。GH对奶牛的乳腺发育、乳汁生成和泌乳的维持也起着重要作用。摘除垂体-肾上腺-卵巢(三重手术)的大鼠或小鼠，应用牛GH、E2和肾上腺皮质激素能刺激乳腺导管生长。在切除垂体-卵巢的反刍动物山羊，应用E2、P4、PRL和GH等能有效刺激乳腺发育到接近妊娠的中期水平。体外试验发现，牛GH能刺激乳腺上皮细胞大量增殖，这些都表明GH对乳腺发育具有直接作用。因此，研究奶牛乳腺的发育和泌乳机理，在提高奶牛的生产性能及改善乳品质方面起着重大作用[1]。

乳蛋白是乳中最重要的成分，主要分为酪蛋白(casein,CN)和乳清蛋白(whey protein)两大类，其中酪蛋白约占80%；剩下乳蛋白含量的20%左右为乳清蛋白[2-4]。而酪蛋白包括α-酪蛋白(α-casein,α-CN)、β-酪蛋白(β-casein,β-CN)、κ-酪蛋白(κ-casein,κ-CN)，其中β-酪蛋白是大型家畜的主要乳蛋白，也是一种高效表达的乳蛋白。奶牛乳腺炎是奶牛最常见的疾病之一，导致奶牛的产奶量下降，奶品质降低，给养殖业造成巨大的经济损失[5-6]。而引起奶牛乳腺炎最主要的致病原因是病原微生物的感染[7]，入侵的致病微生物释放毒素并诱导乳腺上皮细胞释放趋化剂，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素(IL-6、IL-8)和干扰素γ(IFN-γ)，破坏乳腺上皮细胞，致使奶牛的产奶量下降[8]。

抗生素可治疗乳腺炎，但抗生素在牛乳中的残留却威胁着人类健康，且长期使用抗生素的治疗效果也在降低[9]。同时随着抗生素的滥用和误用，产生了越来越多的耐药菌株。中药具有低毒、无残留、无耐药性、无污染等优点，具有广阔应用前景。葎草属传统的中药，具有清热，抗氧化，利尿，消淤，抗炎，抗肿瘤和抑菌等功效，且葎草提取物中的黄酮具有抑菌、止泻和消炎的作用[10-11]。邹素华[12]等采用葎草提取物进行饲喂羔羊，结果表明，对其生长和免疫等都有不同程度的提高。李晓翠[13]等在饲喂奶牛时添加葎草活性饲料添加剂后，发现试验组奶牛产奶量均有不同程度的提高。葎草作为绿色饲料资源具有很高的利用价值，其提取物在哺乳动物的泌乳量和奶品质方面还需进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验细胞株 奶牛的乳腺上皮细胞(MAC-T)，由美国ATCC生物资源中心所提供。

1.1.2 试验药物 葎草来自河南牧业经济学院实验基地，2015年9月采集，经邓红雨副教授鉴定为中药葎草。

1.1.3 试剂 芦丁标准品由中国药品生物制品检定所提供；高糖DMEM培养基为美国Hyclone公司产品；无支原体胎牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所生产；胰蛋白酶为Gibco公司产品；青霉素链霉素溶液-双抗为Gibco公司产品；MTT试剂和磷酸盐缓冲液PBS为Sigma公司产品；DMSO(Solarbio)为北京索莱宝科技有限公司产品；DEPC水为北京鼎国生物技术有限责任公司产品；PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、RNAiso Plus和Trizol试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品； 反转录试剂盒为上海复星长征医药科学有限公司产品；荧光定量酶为宁波瑞源生物有限公司产品；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit，Tianscript RT kit cDNA第一链合成试剂盒为天根生化公司产品；常规生化试剂或药品均为分析纯产品。

1.1.4 主要仪器 电子天平为北京赛多利斯科学仪器有限公司产品；756MC紫外可见分光光度计为上海精密仪器有限公司分析仪器总厂产品；高压灭菌锅为上海申安医疗器械厂产品；HH-4数显恒温水浴锅为金坛市金南仪器制造有限公司产品；超低温冰箱和制冰机为日本SANYO公司产品；CO2培养箱为美国FORMA公司产品；TMS Nikon倒置显微镜为日本尼康公司产品；超净工作台为苏州净化设备厂产品；微量取样器、12 000 r/min离心机、荧光定量PCR仪为德国Eppendorf公司产品；温度梯度PCR分析仪为德国Biometra T gradient公司产品；八连管为宁波美康科技股份有限公司产品；酶标仪为美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 葎草醇提物的制备 葎草收割后晾干，取干净晾干的葎草5 g，在750 mL/L的乙醇浓度，料液比为1∶20，超声提取时间为50 min，温度为50℃的条件下进行超声加热提取，用脱脂棉过滤得滤液，用旋转蒸发仪进行浓缩至50 mL(以芦丁为标准品，用分光光度计测得其中黄酮类物质含量为3.47%)。将葎草醇提物与DMSO的比例[14](50 mg∶0.32 mL)，用生理盐水稀释后，将其定容至50 mL，呈黄色混悬液，放4℃保存。

1.2.2 细胞培养 MAC-T细胞快速解冻后加入25 cm3细胞培养瓶中，之后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基(含10 g/L青链霉素)，在37℃、95%湿度条件下，培养于体积分数为5%的CO2的培养箱中，每2 d更换1次培养液。

1.2.3 细胞浓度依赖性试验 取对数生长期的细胞，经500 μL胰蛋白酶消化制成细胞悬液，将细胞接种于6孔培养板中培养24 h，试验共设6组，药物处理组(5组)加入新鲜配制的含不同终浓度的黄酮溶液 (100、200、400、600、800 mg/L)的培养液，每一浓度设3个复孔，每孔加110 μL～120 μL(约106个细胞)细胞悬液，之后每孔再加不同浓度配制的培养液2 mL。另取3个复孔，每孔加入含100 mL/L的胎牛血清培养液作为空白对照组。6组常规条件下培养12 h，用倒置显微镜观察细胞形态并提取细胞中的总RNA。

1.2.4 细胞时间依赖性试验 取对数生长期的细胞，经500 μL胰蛋白酶消化制成细胞悬液，将细胞接种于6孔培养板中培养24 h，试验共设7组，用400 mg/L的黄酮溶液刺激细胞，分6个时间点(1、4、9、12、16、24 h)培养，每一时间点设3个复孔，每孔加110 μL～120 μL(约106个细胞)细胞悬液，之后每孔再加400 mg/L黄酮溶液配制的培养液2 mL。另取3个复孔，每孔加入含100 mL/L的胎牛血清培养液作为空白对照组。7组常规条件下培养不同时间，用倒置显微镜观察细胞形态并提取细胞中的总RNA。

1.2.5 细胞中总RNA的提取及浓度测定 ① 取6孔板中的细胞，每孔各加入1 mL Trizol试剂，反复吹打，从6孔板中移至1.5 mL的EP管中，整过过程在冰上操作。 ②加入200 μL氯仿，剧烈振荡(或votex)15 s，室温静置2 min～3 min。 ③12 000 r/min 4 ℃离心15 min，吸取上清液转移至另一新的EP管中。 ④向上清中加入500 μL异丙醇，混匀，在室温下静置10 min。 ⑤12 000 r/min 4℃离心10 min，收集沉淀。 ⑥弃上清，加入750 mL/L乙醇(DEPC水配制)1 mL，12 000 r/min 4℃离心5 min之后，弃去乙醇。 ⑦重复步骤⑥，以洗净沉淀。 ⑧ 扣干上液，加入10 μL～20 μL DEPC水溶解沉淀，58℃孵育2 min～3 min，溶解完全后放于-80℃冰箱。 ⑨ 取1 μL测定样品RNA的质量，确定样品中总RNA的浓度。 ⑩ 用DEPC水调至总RNA浓度在1 000 ng/μL。

1.2.6 cDNA的合成 本试验采用PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser试剂盒，合成后放入-20℃冰箱保存。操作步骤为：①基因组DNA的除去反应(添加无先后顺序)，反应总体系为10 μL ：总RNA 1 μL、RNase-Free.dH2O 6 μL、gDNA Eraser 1 μL、5×DNA Eraser buffer 2 μL。PCR的反应条件为：42℃ 2 min。②反转录反应(严格按顺序添加)，反应总体系为20 μL：样品反应液10 μL、RNase Free dH2O4 μL、5×Prime Script bufer 4 μL、RT Primer Mix 1 μL、Prime Script RT Enzyme 1 μL。PCR的反应条件为：42℃ 15 min；85℃ 5 s。

1.2.7 荧光定量PCR 用酶标仪对PCR扩增后的cDNA进行浓度测定，对目的基因PRL、 GHR、β-CN、IL-6、 IL-8、 TNF-α和 IFN-γ进行荧光定量测定。Q-PCR的反应总体系为10 μL：cDNA模板1.25 μL，上、下游引物各0.1 μL，ddH2O 3.55 μL，SYBR®Premix ExTaqTMⅡ 5 μL。Q-PCR的反应条件为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，70℃ 20 s进行40个循环。 以GAPDH为内参，用2-△△Ct法分析各基因在乳腺上皮细胞中mRNA的相对表达量。

1.2.8 引物设计与合成 参照GenBank数据库中所提供的牛各基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列、退火温度(Tm)，产物的长度及编录号等信息见下表。

表1 PCR的引物序列，退火温度及产物长度

2 结果

2.1 不同浓度黄酮溶液对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子表达的影响

相对于对照组，不同浓度的黄酮溶液刺激奶牛乳腺上皮细胞12 h后，IL-6在黄酮浓度为100 mg/L～800 mg/L时表达量降低且差异均显著(P<0.05)，但在800 mg/L时表达量最低；IL-8的表达量在黄酮浓度为800 mg/L时也有所降低，但差异不显著(P>0.05)；在黄酮浓度为100 mg/L～600 mg/L时TNF-α的表达量都降低，但在200 mg/L时表达量最低(P<0.05)；IFN-γ的表达量在黄酮浓度为200 mg/L～400 mg/L时有所降低，但在200 mg/L时其表达量最低(P<0.05)(图1)。

2.2 不同浓度黄酮溶液对奶牛乳腺上皮细胞泌乳因子表达的影响

与对照组相比，不同浓度的黄酮溶液刺激奶牛乳腺上皮细胞12 h后，黄酮浓度在200 mg/L时，具有促进GHR表达的作用，但差异不显著(P>0.05)；在黄酮的浓度为100 mg/L～800 mg/L时，对β-CN的表达有上调的作用，200 mg/L～400 mg/L 的黄酮浓度对β-CN的表达可显著提高(P<0.05)，但在黄酮浓度为400 mg/L时，β-CN的表达量最高(图2)。

2.3 相同浓度黄酮溶液对奶牛乳腺上皮细胞炎症因子表达的影响

与空白对照组相比，相同浓度(400 mg/L)的黄酮溶液作用于乳腺上皮细胞不同时间，IL-6在作用于细胞4 h～9 h时表达量降低(P<0.05)，但在作用9 h时表达量最低；IL-8在作用1 h时表达量降低，差异显著(P<0.05)；TNF-α在作用1 h～24 h时表达量都降低，但在12 h时，其表达量降低明显(P<0.05)；IFN-γ的表达量与对照组相比在作用细胞1 h～24 h时也降低，但在12 h时降低显著(P<0.05)(图3)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Different lowercase letters mean significant difference(P<0.05)

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Different lowercase letters mean significant difference(P<0.05)

2.4 相同浓度的黄酮溶液对奶牛乳腺上皮细胞泌乳因子表达的影响

与对照组相比，相同浓度(400 mg/L)的黄酮溶液作用于乳腺上皮细胞不同时间，在作用于细胞4 h～9 h时对GHR的表达都有促进作用，但在作用4 h时其表达明显升高(P<0.05)；在作用4 h～12 h时，对β-CN的表达也有促进作用且差异显著(P<0.05)，但在作用12 h时表达量最高(图4)。

3 讨论

3.1 葎草黄酮对乳腺上皮细胞炎性因子表达的影响

周平平等[16]通过提取葎草中的挥发油、多糖及黄酮成分，研究葎草提取物对仔猪腹泻的治疗效果，结果表明葎草挥发油、葎草多糖和葎草黄酮都能显著抑制大肠杆菌引起的腹泻。韩军艳等[17]通过腹腔注射金黄色葡萄球菌建立动物腹泻模型，结果表明高剂量(黄酮含量3.47%，0.6 mL)的葎草黄酮对金黄色葡萄球菌有极显著的抑制作用。本试验中，不同浓度的黄酮溶液刺激奶牛乳腺上皮细胞12 h后，IL-6和IL-8在黄酮浓度为800 mg/L时表达量最低；TNF-α和IFN-γ在黄酮浓度为200 mg/L时表达量最低(图1)；相同浓度(400 mg/L)的黄酮溶液作用于乳腺上皮细胞不同时间，IL-6、TNF-α和IFN-γ在作用于细胞9 h～12 h时表达量最低，IL-8在作用于细胞1 h时表达量最低(图3)。这表明黄酮浓度为800 mg/L，作用于乳腺上皮细胞9 h，能显著降低IL-6炎症因子的表达，黄酮浓度为200 mg/L，作用于乳腺上皮细胞12 h，能显著降低TNF-α和IFN-γ的表达。

图3 白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ表达水平的变化

图4 生长激素受体和β-酪蛋白表达水平的变化

3.2 葎草黄酮对乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

万中英等[18]研究王不留行增乳活性单体对奶牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳性能的影响，应用CASY细胞分析仪及HPLC，检测乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达情况，试验结果表明,王不留行邻苯二甲酸二丁酯对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达有显著提高的作用，可提高乳腺上皮细胞的泌乳能力。本试验中，不同浓度的黄酮溶液作用奶牛乳腺上皮细胞12 h后，黄酮浓度在200 mg/L～400 mg/L时能促进β-CN的表达，但黄酮浓度为400 mg/L时其表达量最高(图2)；相同浓度(400 mg/L)的黄酮溶液作用于乳腺上皮细胞不同时间，在作用于细胞4 h～12 h时对β-CN的表达有促进作用，而在作用12 h时其表达量最高(图4)。这表明黄酮浓度为400 mg/L，作用于乳腺上皮细胞12 h时，对乳腺细胞的生长发育起重要作用。

3.3 葎草黄酮对乳腺上皮细胞生长激素受体表达的影响

郭旭东[19]研究芦丁对大鼠内分泌的影响，其结果显示，大鼠乳腺组织中E2、PRL、GH的表达水平显著高于对照组。本试验中，不同浓度的黄酮溶液刺激奶牛乳腺上皮细胞12 h后，黄酮浓度为200 mg/L时GHR的表达量升高，但差异不显著(图2)；相同浓度(400 mg/L)的黄酮溶液作用于乳腺上皮细胞不同时间，在作用于细胞4 h～9 h时对GHR的表达有促进作用，但在作用4 h时其表达量最高(图4)。这表明黄酮浓度为400 mg/L，作用于乳腺上皮细胞4 h时，对乳腺细胞的生长发育起促进作用。

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Effects ofHumulusscandensFlavonoids on Related Gene Expressions of Mammary Gland Epithelial Cells

MAO Zhi-bin1,ZHAO Kai-ke1,JIANG Qing-Dong2,ZHENG Li2,LIU Tai-yu1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou，Henan，450000,China; 2.HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou，Henan，450000,China)

The aim of this study was to explore the effects ofHumulusscandensflavonoids on related gene expressions of mammary gland epithelial cells. The cow mammary gland epithelial cells were used as cell model, and the survival and growth of the cells were detected by MTT method, the cow mammary gland epithelial cells were stimulated with different concentration of flavonoid solution (0, 100, 200, 400, 600, 800 mg/L) for 12 h, in the same time, the cow mammary gland epithelial cells were stimulated with the same concentration of flavonoid solution (400 mg/L) at different time (0 ,1, 4, 9, 12, 16, 24 h), and total RNA was extracted from cells respectively. The expressions of GHR, β-CN, IL-6, IL-8, TNF-α and IFN-γ those are lactation-related genes were measured by the fluorescent quantitative PCR. The effects of total flavonoids fromHumulusscandensextract on milk fat metabolism were studied. The experimental group was compared with the blank control group, the expression levels of IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-8 in the cow mammary gland epithelial cells were decreased (P<0.05); The expressions of GHR and β-CN were higher than that of the control group (P<0.05); The results showed that theHumulusflavonoids concentration of 400 mg/L cultivated for 12 h, had a positive effect on the expression of β-CN;Humulusflavonoids concentration of 400 mg/L cultivated for 4 h, the expression of GHR had a role in promoting. This indicated that it plays an important role in the growth and development of mammary gland cells.

flavonoids;Humulusscandens; cow; mammary gland epithelial cell; gene expression

2016-04-06

河南省重大科技专项(121100111000)；郑州反刍动物营养重点实验室建设项目(2014zzlab120010)

毛智斌(1989-)，女，河南郑州人，硕士研究生，主要从事反刍动物营养生理研究。*通讯作者

S857.26

A

1007-5038(2017)05-0053-06