聂海英，唐廷崇，杨善忠，何家康*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西南宁 530003)



复方苦玄参颗粒提取工艺的优化

聂海英1，唐廷崇2，杨善忠2，何家康1*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西北斗星动物保健品有限公司，广西南宁 530003)

为优选复方苦玄参颗粒的提取工艺。以苦玄参苷IA含苷量为考察指标，选择提取次数、碱提取pH、提取时间为考察因素，通过正交试验筛选最佳提取工艺。结果表明，最佳提取工艺为碱提取pH11，提取3次，提取时间1 h。优选的提取工艺稳定性好，合理可行，可进行中试生产。

正交设计；复方苦玄参颗粒；提取工艺；高效液相色谱

复方苦玄参颗粒由苦玄参、地榆、甘草三味中药材经提取加工制备而得，具有清热泻火、消炎止痢等功效，主用于湿热泻痢，禽沙门菌病。该制剂的主药为苦玄参，苦玄参为玄参科植物苦玄参(PicriafelterraeLour.)的干燥全草，别名苦草、四环素草等，味苦，性寒，具有清热解毒、消肿止痛的功能[1-3]。为了筛选该制剂的最佳提取工艺，本研究以含苷量(含苷量=浸膏量×苦玄参苷IA含量)为考核指标，对影响提取工艺的3个因素(提取次数、碱提取pH、提取时间)进行考察，以正交试验优化处方的提取工艺，以期为该制剂的中试生产工艺提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试药 Waters 2695高效液相色谱仪(HPLC)，美国Waters公司；色谱柱，Phenomeneluna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，广州菲罗门公司；HH-4型恒温水浴锅，常州奥华仪器有限公司；TD-400型台式低速离心机，成都市苏净科学器材有限公司；AL-104型电子分析天平，上海精密仪器有限公司；Delta 320-S pH计：METTLER TOLEDO公司。苦玄参苷IA对照品购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈，均为色谱级，美国Fisher公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 药材 苦玄参、地榆、甘草药材，均购自广西玉林中桂药材有限公司，各药材均符合《中国兽药典》2015年版二部各药材项下规定。

1.2 方法

1.2.1 复方苦玄参颗粒中苦玄参苷IA的含量测定

1.2.1.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(35∶65)为流动相，检测波长为264 nm，柱温35 ℃，流速1 mL/min，检测时间45 min，理论塔板数按苦玄参苷IA峰计算应不低于4000[4-6]。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 取苦玄参苷IA对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取正交试验设计的9种提取工艺提取后的浸膏约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用60%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm滤膜，HPLC法测定，计算苦玄参苷IA含量[7]。

1.2.1.4 阴性样品的制备 按标准处方比例，制备缺苦玄参的阴性颗粒样品，再按供试品的制备方法制备阴性样品溶液。

1.2.1.5 测定方法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图。9 种供试品中苦玄参苷IA的含量测定按“1.2.1.1”项下的色谱试验条件和“1.2.1.3 ”项下供试品溶液的制备进行，重复测定3次求平均值，采用外标法计算颗粒中苦玄参苷IA的含量。

1.2.1.6 线性关系考察 精密吸取1.2.1.2苦玄参苷IA对照品液适量，用甲醇稀释成20.08、41.60、62.40、83.20、105.40 μg/mL五个不同浓度的对照品溶液，HPLC测定，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制苦玄参苷IA的标准曲线。

1.2.1.7 精密度试验 精密吸取同一苦玄参苷IA对照品溶液，按“1.2.1.1”项下的色谱试验条件重复进样6次，计算方法的精密度。

1.2.1.8 重复性试验 取同一批样品6份，精密称定，按“1.2.1.3 ”项下制备供试品溶液，按“1.2.1.1”项下的色谱试验条件进行测定，计算方法的重复性。

1.2.1.9 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样测定，考察供试品溶液的稳定性。

1.2.1.10 加样回收试验 取已知含量的同一批样品6份，精密稳定，分别加入苦玄参苷IA对照品溶液适量，按“1.2.1.3 ”项下制备供试品溶液，依法进样，测定含量，计算回收率。

1.2.2 苦玄参苷IA的提取 取复方苦玄参药材粉末10 g，置于250 mL圆底烧瓶中，料液比为10倍，按试验设计的条件于恒温水浴中浸提，收集提取液，浓缩至原液的1/4，4 000 r/min离心10 min，取上清液倒入干燥至恒重的平皿中，水浴蒸干，105 ℃干燥至恒重，即可得到复方苦玄参浸膏。

1.2.3 复方苦玄参颗粒提取工艺优化 用正交试验优化复方苦玄参颗粒最佳的提取工艺，选用影响提取效果的3个主要因素：提取次数(A)、碱提取pH(B)、提取时间(C)，称取约10 g处方药材共9份，按正交表L9(34)进行试验，因素水平设计见表1。以含苷量为考察指标，对提取条件进行优选；含苷量的计算公式：含苷量(mg)=浸膏量(mg)×苦玄参苷IA含量(mg/mg)。

不同pH水溶液的配制：在室温下，先配制20% NaOH溶液，然后用胶头滴管吸取该碱溶液滴加到待进行处方药材提取的水溶液中，每次滴加碱溶液并用玻璃棒搅拌后，均用pH计对该水溶液进行pH的测定，直至达到每次所需要的pH(9、10、11)为止。溶液现配现用，将调节pH后的水溶液直接用来进行处方中药的提取。

表1 因素水平表

2 结果

2.1 苦玄参苷IA的含量测定

2.1.1 方法的专属性 苦玄参苷IA对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液的色谱图见图1。从图1中可看出苦玄参苷IA的保留时间为29.4 min，分离度良好，阴性样品对测定无干扰。

A.苦玄参苷IA对照品；B.复方苦玄参颗粒样品；C.阴性样品；1.苦玄参苷IA

2.1.2 方法学考察 线性范围考察结果浓度x(μg/mL)与峰面积y得回归方程为：y=3.484 765x-0.279 430 3，R2=0.999 7，苦玄参苷IA在21.08～105.4 μg/mL范围内线性关系良好；精密度、重复性、稳定性结果的RSD分别为0.16%、0.13%和1.30%；加样回收率计算RSD为1.25%，表明本方法可行。

2.2 正交试验结果

提取工艺正交试验结果见表2和表3。由表2正交试验结果的极差和表3方差分析结果可以看出，因素A对提取结果的影响最大，其次是B和C各因素影响的主次顺序为A>B>C，优化的水平组合为A3B3C2，即碱提取pH 11，提取3次，每次提取1 h。

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析结果

注：F0.05(2，2)=19; F0.01(2，2)=99。19

Note: F0.05(2，2)=19; F0.01(2，2)=99.19

2.3 验证试验

取处方药材粉末约40 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，依据正交试验结果的最佳工艺条件，依法进行提取，即碱提取pH11，提取3次，提取时间1 h。以含苷量为考察指标，结果见表4。由表4可知，按筛选的最佳工艺提取，含苷量基本稳定，RSD为0.29%(n=3)，表明该工艺稳定、可行。

3 讨论

复方苦玄参颗粒的君药为苦玄参，因此本文首先建立颗粒中苦玄参指标性成分苦玄参苷IA的含量测定分析方法，以对不同处方颗粒进行质量监控。正交试验以含苷量(含苷量=浸膏量×苦玄参苷IA含量)为评价指标对该颗粒的提取工艺进行优选，采用全方合煎的方法来进行。苦玄参的主要成分为四环三萜皂苷类。据文献报道，皂苷在热水中溶解度较好，且大部分皂苷易溶于700 mL/L乙醇，植物中的苷类成分常采用水煎煮、醇提或水煮醇沉法进行提取，采用水煎煮的缺点是药液难过滤，杂质多；而采用水煮醇沉法，有可能在除杂过程中使得部分皂苷损失[8]；若提取液的pH过低，含有苷类成分的药液常发生混浊现象，而含有机酸、蒽醌苷和黄酮苷等成分的中药提取液的pH7.5～10范围内为宜[9-10]。故本研究进行复方苦玄参颗粒的提取优化中，引入了碱提取pH这一关键因素。本文同时兼顾了处方中另外2味药(地榆、甘草)的提取效果，因此选用对复方苦玄参颗粒提取工艺影响较大的另外2个因素(即提取次数、提取时间)做为另外2个重点考察的因素。

单因素试验、正交设计试验、响应面法或者均匀设计法等是进行中药提取优化的常用方法[11-17]。本文经过前期对比、筛选后，最终选用正交设计试验，利用正交表L9(34)进行三因素三水平的正交试验，最终优化了复方苦玄参颗粒的提取工艺，获得了最佳的提取工艺条件，即碱提取pH为11，提取3次，每次提取1 h。说明优选的工艺条件稳定性良好，方法简便。

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Optimization of Extraction Technology of Compound Kuxuanshen Granules

NIE Hai-ying1,TANG Ting-chong2,YANG Shan-zhong2,HE Jia-kang1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,P.R.China; 2.GuangxiBeidouxingAnimalDrugsCompanyLTD.,Nanning,Guangxi,530003,P.R.China)

The study aimed to optimize the extraction process of Compound Kuxuanshen Granules.The content of glycoside was used as the evaluation index.The extraction process was optimized by orthogonal test with extraction times,alkali extraction pH and the extraction duration as the influencing factors.The optimal extraction conditions were as follows: Alkali extraction pH 11,the decoction duration 1 h with 3 extraction times.The optimized process of Compound Kuxuanshen Granules were stable,convenient and feasible.It is suitable for scale-up production.

orthogonal test; Compound Kuxuanshen Granules; extraction technology; HPLC

2016-10-02

广西道地中药开发应用项目(CG20150007);国家自然科学基金项目(31360624)

聂海英(1989-)，女，广西玉林人，硕士生，主要从事中兽医药研究。*通讯作者

S853.7

A

1007-5038(2017)05-0049-04