李荣+张建平

摘 要：该文以构建基因ILKAP的真核表达载体及通过Western-blotting进行检测的创新型试验项目为例，利用现代分子生物学技术，对在校本科生的创新性试验项目的设计方案、实施及试验结果与成效进行了探讨。结果显示，该实验项目的实施，不仅可以培养学生的思维能力和创新意识，提高其实验设计和实际操作的能力，而且提高了学生的主动性和团队协作能力。

关键词：现代分子生物学技术；创新性试验；试验教学改革

中图分类号 G642.0 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0182-03

Abstract：Taking the experiment of “Construction of the eukaryotic expression vector of Flag-ILKAP-pCMV-2b and then detection of the expression by western-blotting in HEK293T cells” as an example，we expored the design scheme，experimantal implementations and results and analysis by the use of modern molecular biological techniques.The implementation of experiment program trained the capability and idea of innovation，foster students' experimental design and operation skills，and also enhanced the initiative and teamwork ability.

Key words：Modern molecular biology technology；Innovation experiment；Experimental teaching reform

創新是一个民族的灵魂，是国家综合国力得以提高的根本，是科学技术迅猛发展的基础。随着社会经济发展和时代进步，社会对高等教育提出了更高的要求，具备“创新精神与创新能力”的创新型人才，已成为知识经济时代发展的迫切需求。大学生作为最具有自主创新能力的社会群体，是创新型国家建设过程中最为积极活跃的因素，因此，激发大学生的创新意识和创新能力，是构建“创新型国家”的重要组成部分[1-3]。

近年来，我国提出了建设创新型国家的战略，开始倡导创新型人才的培养，各类高等院校也在积极探索创新型人才的培养方案，尽管取得了一些经验，但到目前为止还没有获得突破性的进展。创新能力和实践能力的培养是教学改革建设的核心内容和培养质量的重要着力点。无论是培养应用型、复合型和拔尖创新型人才的本科教育，还是培养“高端技能型”的高职教育，学生的创新能力、实践能力培养质量和水平已经成为衡量一所高校人才培养质量的重要因素，直接影响着高校、区域经济与社会的发展[4]。但是，创新能力和实践能力的培养不是一朝一夕就可以完成的，需要长期的积累，需要学生在实践中充分发挥创新精神，从而使学生的创新能力和实践能力得以和谐发展。高校试验教学是高校教学体系中的重要环节，对培养学生的创新能力和实践能力等方面起着不可替代的作用，尤其是对于生命科学这类实验性学科更具有举足轻重的作用[5]。但是，就现在的试验教学来看还存在许多问题，按照目前的水平还不能满足社会对创新型人才培养的要求，这些问题主要体现在下面几个方面：一是虽然生命科学领域，试验技术不断推陈出新，而试验教学过程设备普遍陈旧，验证手段落后，多为一些验证性实验，一般按照试验指导书或黑板板书的实验步骤进行，学生无须深思熟虑，因而不利于培养学生的能动性和创新性；二是试验教学一般一课一题，两人一组，甚而至于为观摩性试验，学生无选择性，并且前后试验间无任何衔接性，因而无法激励学生的缜密的思维逻辑性[6]。

针对以上问题，笔者结合本实验室的条件和科研优势，利用现代分子生物学技术构建了基因ILKAP的真核表达载体及通过Western-blotting进行检测的创新型试验项目。该项目融合了生物化学、分子生物学、基因工程等试验内容于一体，学生根据试验目的与要求，查阅相关文献，独立设计实验技术路线，确定试验方案，从而有利于学生实践操作能力、创新能力和解决问题能力的锻炼，取得了较好的试验教学效果。

1 设计实验项目

洞庭湖地区是日本血吸虫的流行区域，而该区域的东方田鼠（Microtus fortis）是日本血吸虫的非适宜宿主，也是唯一一种能感染血吸虫但不致病具的哺乳动物。学生对该物种的这一特性产生了浓厚的兴趣，因此在已有研究发现东方田鼠骨髓ILKAP基因具有一定的杀虫特性的基础上，学生选择了该课题以中心法则为主线，将ILKAP基因克隆到真核表达载体pCMV-2b，脂质体转染HEK293T细胞，建立ILKAP-Flag高表达的HEK293T细胞系，并通过Western-blotting来检测其是否有表达[7]。此试验设计涵盖了本科阶段生命科学专业的生物化学、分子生物学、基因工程、细胞生物学等一系列课程，是一个较为完整的试验设计项目。

2 实施试验项目

真核表达载体pCMV-2b为实验室保存，东方田鼠购买于实验动物中心。首先，教师向学生下达此次创新型项目的任务书，学生根据此任务书查找相关文献，并设计出试验技术路线，安排试验进程，提出在试验实施过程中拟解决的问题，从而提高了学生的积极性。其次，学生在试验过程中常出现的问题有：不知如何设计引物，为何要在上下游引物添加酶切位点，怎样选择合适的限制性核酸内切酶；PCR过程中不知如何设计退火温度；进行转染时细胞的量的估计，Western-blotting没有设计内参等等系列问题。因此，教师有必要先对学生的试验设计进行指导，并要经常进入实验室解决学生遇到的问题，不定时检测学生的试验进度，同时督促学生在试验过程中养成良好的原始试验记录习惯，以及遇到问题时如何妥善处理问题能力的培养。

3 试验项目结果与分析

提取室内封闭群东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫总RNA，用RT-PCR方法检测ILKAP在正常生理状态下的表达情况。RT-PCR结果显示：ILKAP在东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫中均有表达，根据ILKAP全长酶切位点分析结果和质粒pCMV-Tag 2b多克隆酶切位点分析，选择Sma I和Not I作为限制性核酸内切酶，酶切过夜，T4 DNA 连接酶16℃过夜，连接目的基因和去磷酸化处理后的空载体，重组后的质粒经酶切初步鉴定后，送Invitrogen公司测序验证（图1）。重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b构建成功后，转染至HEK293T细胞，其中空质粒的转染作为空白对照，培养细胞48h后收集上清用于Western-blotting检测。通过Western blotting，SDS-PAGE转膜后，以Flag抗体与PVDC膜共孵育，发现只有实验组有条带，而对照没有条带出现（图2）。

在整个实验过程中，学生遇到了很多“拦路虎”，例如在设计引物时不知如何利用生物学软件primer和oligo相結合，原始引物设计好后没有加酶切位点及保护碱基，其次在对目的片段进行PCR扩增时，退火温度的摸索花了很长时间，在这个摸索的过程中学会了如何通过查阅文献以同种属的物种的基因克隆温度作为参考，也学会了梯度PCR的使用；最后在用脂质体转染HEK293T细胞，不知如何评估细胞数，转染后不知何时换液，也不知是否需要添加其他试剂等等。但是学生们都找到了解决问题的方法，最终获得了较为理想的实验结果。

4 试验效果

通过实验项目的实施，学生在以下几个方面有了较大的收获：（1）为保证整个实验项目的顺利进行，首先得从全局着手设计实验方案，促进学生自主的去学习课本及试验指导书之外的知识；（2）学生通过参加科研项目，培养了他们的团队协作能力，同时也提高了学生的沟通能力，项目完成后，学生还需整理相关资料和数据，完成并撰写，为日后毕业论文的协作打下了良好的基础；（3）试验项目的实施极大地激发了学生的求知欲，有助于学生创新意思的培养以及独立试验技能的提高，同时也通过试验结果感受到了科学探究所带来的成就感。例如，在经历了western blotting的多次失败的磨练后，到现在感觉只要抗体合适，几乎就没有他们做不出来的分子，通过系列试验的成功，给了学生无穷的自信，使学生对生物科学产生了浓厚的兴趣，同时也在试验过程中感受到了成功的喜悦。（4）在试验过程中，我们明显感觉到学生逐步形成了发现问题、思考问题、解决问题的科学意识，同时分析和解决问题的能力大大加强。比如，在做脂质体转染试验时，学生做了很多尝试来提高转染效率。为了确保转染在对数生长期内进行，学生先绘制培养细胞的生长曲线、确定其对数生长期，然后再着手做转染；其次在保证DNA的质量的前提下，学生按照DNA和转染试剂的比例做了曲线分析，看看reporter的表达效率，以求做到最好的转染效率。（5）极大提高了学生的试验操作技能。我们平时理论课和实验课上的一些内容例如DNA的琼脂糖凝胶电泳，虽然理论上有强调，但实际训练却很少，尤其是对于大二年级的学生而言很多实验根本就没有开展过，创新实验项目的开展，从实验准备到试验结果的观察都是一个全新的体验，学生通过一些列的的生物学试验，提高了学生的动手操作能力，锻炼了试验思维，对于学生而已收获颇丰，这是传统的试验所无法到达的试验效果。

5 结语

高等院校生物科学专业开展创新型实验是传统的验证性试验向研究创新性试验的转变，有利于培养学生学习的兴趣和探索科学理论的强烈欲望，能为改进实验教学改革提供新的思路，有利于多方面、多层次、全方位地培养学生的素质和能力。大学生在校期间参加科研项目，无论是对于专业知识的深入了解还是对于日后的就业问题，都有很大的益处。今后将继续深入探索生物科学试验教学改革、试验创新意识的培养和试验技能的提高三者之间的相互整合，以利于创新型、应用型的复合型人才的培养。

参考文献

[1]韩宏岩，许维岸.生物类本科生综合实验设计与实践的探索[J].实验室研究与探索，2014，3（33）：168-171.

[2]侯勇，龚竞，敬成俊.综合性酶学实验与学生创新能力的培养[J].实验科学与技术，2009，7（3）：90-91.

[3]梁晓夏，王国庆，冯家勋，等.生物类本科生综合性实验设计与实践[J].实验科学与技术，2009，7（3）：116-118.

[4]涂铭旌，唐英，张进，等.创新型人才培养的思路、方法及路径（一）[J].西华大学学报，2012，04：1-5.

[5]彭喜旭，唐新科，王海华.植物学与分子生物学研究创新型实验项目的设计与实施[J].安徽农学通报，2011，17（11）：212-214.

[6]李素康，韩锟.关于高校实验教学改革的研究[J].长沙铁道学院学报（社会科学版），2005，16：1-3.

[7]熊德慧.东方田鼠抗日本血吸虫相关基因E77.43全长cDNA的克隆及生物信息学分析[D].长沙：中南大学，2009.

（责编：张宏民）