郑雪媚+罗少健+黄炜乾+唐谢芳

摘 要：目的：采用HPLC法测定地顶孢霉培养物中虫草素的含量。方法：测定色谱条件为：色谱柱为C18，5μm，4.6mm×250mm，流动相为乙腈—水（95∶5），检测波长为260nm。结论：虫草素在1～50μg/mL范围内线性关系良好，相关系数R2为0.999 8；虫草素的回收率为98.7%～101.6%；虫草素的测定重复性RSD为0.62%。结论：该方法线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好，为其质量控制提供了依据。

关键词：虫草素；地顶孢霉培养物；HPLC；含量测定

中图分类号 S476.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0034-02

Abstract：Objective：High performance liquid chromatographic method was used for the determination of the content of the Cordycepin in the culture of Acremonium terricola.Determination of chromatographic conditions：column as C18（5μm，4.6mm×250mm），mobile phase as acetonitrile -water （95∶5，v/v），detection wavelength of 260nm.Conclusion：Cordycepin showed a good linear relationship at range of 1～50μg/mL（R2=0.999 8）.The recovery rate of cordycepin was 98.7% to 101.6%.The RSD Cordycepin was 0.62%.Conclusion：This method showed a wide linear range of the determination，a short analysis time，simple pre-treatment of samples，quantitative results and a good reproducibility.It provided the basis for the quality control.

Key words：Cordycepin；The culture of Acremonium terricola；HPLC；Determination of content

冬虫夏草（Cordycepssp）是麦角菌科真菌寄生在鳞翅目蝙蝠科昆虫蝙蝠娥幼虫上的干燥子座和虫体，是中国名贵药材。冬虫夏草的主要功能性成分为虫草酸（Cordycepic）、虫草素（Cordycepin）、虫草多糖（Cordyceps polysaccharide）、氨基酸、生物碱、抗菌活性物质以及微量元素和免疫抑制剂等[1]。研究表明，虫草具有提高免疫能力，促进特异性抗体的产生和增强机体免疫应答等功能。但虫草素价格昂贵、资源有限，制约了其在畜禽生产中的应用。

地顶孢霉培养物主要成分是虫草素，属于虫草饲料添加剂的一种，被收录在农业部颁布的《饲料添加剂目录》（2013年）中。其采用发酵工业工艺技术生产，实现虫草生产的产业化，很大程度上低了生产成本，为虫草素在养殖行业中规模化應用奠定了基础。地顶孢霉培养物与天然虫草具有基本相同的有效成分，并且人工培养方法简单、便于大规模生产，利于在畜牧生产上推广应用[2]。

本文按照中国兽药典要求[3]，根据虫草素的结构特点，建立了测定地顶孢霉培养物中虫草素含量的HPLC法。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为地顶孢霉培养物的质量控制提供科学依据。

1 实验

1.1 试剂与仪器 日本岛津SPD-20A液相色谱仪；柱温箱CTO-20AC；超纯水仪UPR-5T；超声波清洗器KQ-500DE；天平METTLER MS105DU；虫草素标准品来源：中国食品药品检定研究院；水为超纯水，乙腈为色谱纯。

1.2 色谱条件 流动相∶乙腈∶水=95∶5；色谱柱：菲罗门C18（5μm，4.6mm×250mm）；检测波长：260nm；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL。

1.3 对照品溶液的配制 （1）稀释液：流动相。（2）对照储备液：精密称取对照品10mg（实际称样量10.56mg，对照品含量95.5%），以稀释液溶解并稀释至50mL，制成约200μg/mL的对照储备液。（3）取上述对照储备液5.0mL到100mL容量瓶中，加稀释液定容，制成约10μg/mL的对照液。

1.4 样品溶液的配制 精密称取500mg试样到100mL容量瓶中，加稀释液适量溶解，超声30min，定容，过滤即得。

1.5 系统适用性试验 取上述10μg/mL的对照溶液10μL分别按1.2色谱条件下进样，测定并计算柱效、分离度和拖尾因子（见表1）。

1.6 线性试验 取上述对照品储备溶液分别稀释成50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL的系列对照品溶液，按1.2色谱条件测定，以峰面积对浓度进行回归，虫草素峰面积的回归方程分别为：Y=58852X（R5=0.999 8），说明虫草素在1～50μg/mL范围内具有良好的线性关系（图1）。

1.7 重复性试验 精密吸取同一批供试品溶液，按1.2项色谱条件测定，进样6次，得虫草素峰面积的RSD为0.62%，表明样品重复性良好（表2）。

1.8 回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品（含量为1 904μg/g）约0.25g（共9份）置于100mL容量瓶中，分别加入对照储备液1.5mL、2.5mL、3.5mL，按上述1.4项要求处理，进样测定。样品虫草素的回收率为99.5%（表3）。

1.9 检测限 在上述色谱条件下，测定最低检测限为2ng（S/N≥3）。

1.10 供试品的测定 取3批样品及标准溶液，按外标法测定，每批样品进样2次，计算样品中虫草素含量（图2）。3批样品的含量测定结果分别为1 905μg/g、2 005μg/g、2 101μg/g。2 结论

本实验建立了HPLC法测定地顶孢霉培养物中虫草素的含量的方法，测定色谱条件为：色谱柱为菲罗门 C18（5μm，4.6mm×250mm，流动相为水-乙腈（5∶95），流速为1.0mL/min，检测波长为260nm，在1～50μg/mL范围内线性关系良好。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为其质量控制提供了依据。

参考文献

[1]刘彦威，刘娜，刘利强.冬虫夏草有效成分的研究进展[J].动物医学进展，2004，25（3）：51-53.

[2]李洋，窦秀静，王一臻，等.虫草饲料添加剂对畜牧生产性能和免疫调节的影响以及其应用前景[J].中国畜牧杂志，2016，52（3）：67-71.

[3]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（二部）[S].北京：中国农业出版社，2010.

（责编：张宏民）