王盼+王毅红+方玉梅

摘 要：该研究采用邻苯三酚自氧化法和水杨酸分光光度法，测定了金荞麦70%醇提物清除超氧阴离子自由基（O-2）以及羟基自由基（·OH）的效果。结果表明：金荞麦总黄酮提取物能显著地清除超氧阴离子和羟基自由基，且随提取物浓度的升高其抗氧化性作用逐渐增强[1]。

关键词：金荞麦；总黄酮提取物；超氧阴离子；羟基自由基

中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0023-02

Abstract：The scavenging effect on superoxide anion and hydroxy radical of 70% ethanol extract is determined using the pyrogallol autoxidation and the salicylic acid method from Fagopyrum dibotrys.The results show Fagopyrum dibotrys（D.Don） Hara flavonoids can remove superoxide anion radical（O-2） and hydroxyl radical（·OH） remarkably.With the concentration of flavonoids increasing in Fagopyrum dibotrys （D.Don） Hara，their antioxidant activities have gradually increased.

Key words：Fagopyrum dibotrys （D.Don） Hara；The total flavone extract；Superoxide anion；Hydroxy radical

金荞麦[Fagopyrum dibotrys （D.Don） Hara]系蓼科荞麦属植物，别名野桥荞麦、天荞麦，其干燥根茎供药用，微辛、涩、凉，归肺经[1]，具有清肺排痰、排脓消肿、祛风化湿、活血化瘀、健脾利湿的功效[2]。据相关文献报道，利用各种色谱和光谱方法分离和鉴定出金荞麦中含有原儿茶酸甲酯、反式对羟基桂皮酸甲酯、红车轴草黄酮、β-谷甾醇、β-胡萝卜苷、海柯皂甙元、原矢车菊甙元等多种黄酮类、甾体、有机酸类、苷类等化学成分[3-5]。

黄酮类化合物是大自然中的一大类化合物，它在食品方面和医药工业方面上有着广泛应用，其有着增强心血管功能，抗肿瘤，增强免疫力，减缓衰老和治疗慢性前列腺炎等作用[6]。清除氧自由基的能力是评价一种抗氧化物质生理作用大小的重要指标，本研究使用邻苯三酚自氧化和水杨酸比色法分别测定金荞麦总黄酮提取物清除超氧阴离子（O-2）和羟基自由基（·OH）的效果，对金荞麦黄酮类化合物的抗氧化性进行了探究，以期为未来开发外源性抗氧化剂做一些研究工作，为合理利用中草药资源提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料 金荞麦采自钟山区明湖湿地公园山上，洗净、烘干至恒重（65℃），粉碎；芦丁标准品（比利时进口，北京化学试剂有限公司）；邻苯三酚，硫酸亚铁，水杨酸，亚硝酸钠，三羟甲基氨基甲烷（Tris），硝酸铝，无水乙醇，氢氧化钠等药品都是国产分析纯。Mettler Toledo AL204电子天平 （梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；SP-2000可见光度计（北京瑞利公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）；DFT-200高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 将芦丁标准品置于电热鼓风干燥箱中120℃干燥至质量恒定，然后称取10mg已处理的芦丁标准品，用70%乙醇溶解并定容至100mL，得浓度为100μg/mL的芦丁溶液。将芦丁溶液用70%乙醇稀释成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，分别取1mL于试管中，依次加入1mL70%乙醇，0.3mL5%NaNO2溶液振荡均匀，放置6min，加入0.3mL 10%Al（NO3）3溶液振荡均匀，放置6min，加入2mL 4%NaOH溶液，振荡均匀，放置10min，在最大吸收波长（510nm）处分别测定吸光度A[7]。用最小二乘法经线性回归，得芦丁浓度C（μg/mL）与吸光度A的回归方程A=0.002618C-0.01311，R=0.999 5。结果表明线性关系良好。

1.2.2 金荞麦总黄酮提取物含量的测定 准确称量金荞麦粉末1g于圆底烧瓶中，加入30mL70%乙醇摇匀，于水浴中浸提2h，过滤后用70%乙醇定容至50mL，此为金荞麦总黄酮提取液。移取2mL提取液到10mL容量瓶中，用70%乙醇定容，振荡均匀后，移取1mL该稀释液到试管中，依次加入1mL 70%乙醇，0.3mL 5%NaNO2溶液振荡均匀，放置6min，加入0.3mL 10%Al（NO3）3溶液振荡均匀，放置6min，最后加入2mL 4%NaOH溶液，振荡均匀，放置10min[1]，在510nm下测得金荞麦总黄酮提取液的吸光度A=0.739，通过回归方程计算得金荞麦总黄酮提取物浓度C=287.284μg/mL。

1.2.3 金荞麦总黄酮提取物对羟基自由基（·OH）的抑制率 反應体系：在25mL容量瓶中加入5mL2mmol·l-1

FeSO4，5mL6mmol·L-1 H2O2，振荡均匀加入15mL6mmol·l-1水杨酸-乙醇，置于37℃水浴中15min后拿出，用双蒸水作为参比，在510nm下测吸光度，接着加入1mL被测定样品，振荡均匀，在37℃水浴中15min后拿出，用双蒸水为参比，在510nm下测吸光度。由于色素本身具有吸收光值，所以用5mL2mmol·l-1FeSO4，15mL6mmol·l-1水杨酸-乙醇，不同浓度的被测溶液1mL和5mL双蒸水作为色素的本底吸收[8]。各取金荞麦总黄酮提取液1mL，2mL，3mL，4mL，5mL置于10mL容量瓶，用70%乙醇定容，此为不同浓度黄酮类化合物的样品液。以下为计算抑制率的公式：抑制率（%）=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100

式中：A0—用蒸馏水代替样品的对照值；Ax—加样后的吸光度；Ax0—样品本身的本底值。

1.2.4 金荞麦总黄酮提取物对超氧阴离子自由基（O-2）的抑制率 （1）邻苯三酚自氧化速率的测定：吸取5mL50mmol/LTris-HCl缓冲溶液（pH=8.2），2mL双蒸水摇匀，置于25℃水浴中20min，取出马上加入0.5mL 3mmol/L邻苯三酚（已提前在25℃水浴中预热，用10mmol/lHCl配制，空白管用等体积的10mmol/lHCl代替邻苯三酚HCl溶液），摇匀后转移至比色皿中，在420nm下每隔30s测定吸光度值[1]。（2）金荞麦总黄酮提取物活性测定：按照上述操作在加入邻苯三酚前先各加入不同浓度的样品液0.2mL，双蒸水减少。以10mmol/lHCl代替邻苯三酚HCl溶液作为空白对照。测定吸光度，计算抑制率。计算公式如下：

抑制率（%）=（A0-A1）/A0×100

式中：A0—邻苯三酚自氧化平均吸光度；A1—加入样品液后邻苯三酚自氧化平均吸光度[1]。

2 结果与分析

2.1 金荞麦总黄酮提取物对羟基自由基（·OH）的抑制作用 由表1可知，金荞麦总黄酮提取物对·OH的抑制作用跟随浓度的增大抑制率也增强，浓度在28.728～143.640μg/mL内抑制率是有效的，当浓度为143.640μg/mL时，抑制率最大，为22.82%。

2.2 金荞麦总黄酮提取物对超氧阴离子自由基（O-2）的抑制作用 按1.2.4方法测定邻苯三酚自氧化速率A0=0.076。测得不同浓度的金荞麦总黄酮提取液对O-2的抑制作用见表2。根据表2可知，在样品浓度为2.873～11.491μg/mL的范围内，随着总黄酮提取物浓度升高，抑制作用增强，且当总黄酮提取物浓度为11.491μg/mL時，抑制率达到40.79%。

3 结论

本实验研究发现，用70%乙醇浸提得到金荞麦总黄酮类提取物浓度为287.515μg/mL，通过金荞麦总黄酮类提取物对羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O-2）抗氧化作用的研究，结果均表明，金荞麦总黄酮类提取物对羟基自由基和超氧阴离子都表现出较强的清除自由基能力，且在一定浓度范围内清除自由基能力都随总黄酮提取物浓度增大抑制作用增强，这与文献报道一致[1]。实验证明，金荞麦总黄酮类提取物具有很强的抗氧化能力，这对于金荞麦的综合利用和进一步开发具有重要意义。

参考文献

[1]谭萍，方玉梅，王毅红，等.苦荞种子黄酮类化合物的抗氧化作用[J].贵州农业科学，2009：37（3）：30-31.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科学出版社，201：203.

[3]邵萌，杨跃辉，高慧媛，等.金荞麦中的酚酸类成分[J].中国中药杂志，2005，30（20）：1591-1593.

[4]吴和珍，周洁云，潘宏林.金荞麦化学成分的研究[J].中国医院药学杂志，2008：28（21）：1829-1831.

[5]刘永漋，房其年，张秀琴，等.金荞麦有效成分的研究[J].药学学报，1983，18（7）：545-547.

[6]顾尧臣.小宗粮食加工（四）荞麦加工[J].粮食与饲料工业，1999（7）：19-22.

[7]张萍，王玉珠，李红宁，等.荞麦中生物类黄酮的提取方法研究[J].食品研究与开发，2007（2）：45-48.

[8]汪河滨，白红进，王金磊，等.黑果枸杞色素清除自由基活性的研究[J].食品研究与开发，2006（11）：8-10. （责编：张宏民）