侯彬彬++宋江涛+马骁+陈福欣+周安宁

摘要：采用NaOH、乙醇复合溶剂对葵花秆进行预处理，通过单因素试验研究了反应时间、温度、固液比、溶剂质量分数及复合溶剂比例对葵花秆木质素去除率的影响，然后利用正交试验法对预处理条件进行优化，得到最佳预处理条件为温度170 ℃，2% NaOH和70%乙醇的复合溶剂体积比为2 ∶[KG-*3]1，固液比1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL），反应时间1 h，該条件下木质素去除率为53.75%。酶解试验表明，木质素去除率越高，葡萄糖产率越高。最后通过红外光谱、扫描电镜对预处理前后的葵花秆进行结构分析，发现预处理后的葵花秆结构遭到破坏，出现不规则的裂痕，木质素与半纤维素之间的结构被破坏，暴露出更多的纤维素和半纤维素。

关键词：葵花秆；预处理；复合溶剂；酶解；木质素

中图分类号：TS721+.1；TQ914.1文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）03-0136-05

收稿日期：2016-04-28

基金项目：国家自然科学基金（编号：51174279）；教育部博士学科专项基金（编号：20116121110005）。

作者简介：侯彬彬（1991—），男，陕西榆林人，硕士研究生，主要从事煤炭基精细化学品合成及有机合成研究。E-mail：774716071@qq.com。

通信作者：周安宁，博士，教授，博士生导师，主要从事煤及生物质多联产转化与功能材料制备研究。E-mail：psu564@139.com。

中国作为传统的农业大国，每年葵花秆产量约7亿多t[1]。葵花秆作为一种重要的生物综合利用资源，在农村多数被就地焚烧或弃置腐烂，不仅浪费资源，也污染环境。葵花秆的主要成分为木质素、纤维素等，可作为生产生物质能源的重要原料[2]。在制备生物乙醇方面，关键步骤是将纤维素、半纤维素水解为单糖，而在自然状态下，木质素像保护层一样包围在纤维素和半纤维素之间，且有很高的结晶度[3]，导致纤维素酶对其水解能力变弱，所以有必要对葵花杆进行木质素脱除。对秸秆木质素进行预处理的方法较多，较早的方法是机械处理法[4]，但成本高；蒸汽爆破处理法[5-6]木质素转化及半纤维素溶解效果好，但易产生有毒物质；微波加热法速率快，所需能量少[7]，可以破坏纤维素的结晶区，降低表皮木质素含量[8]，但对酶水解促进作用小；生物法主要利用白腐菌、褐腐菌、软腐菌、木腐菌对秸秆木质素进行预处理[9-12]，其优点是条件温和，环境友好，但缺点是受菌种及其分泌酶状况的影响，且处理周期长，水解得率较低；碱法可以发生溶剂化、皂化作用，导致生物质膨胀，可有效脱除木质素，与酸法比较，对纤维素、半纤维素的破坏程度较轻，而且会导致纤维素变得比天然纤维素更致密、稳定[13-14]。Mathew等开展了NaOH预处理油菜秸秆用于评价葡萄糖产率的研究，发现碱预处理比酸预处理效果好，碱预处理下产率为44%左右[15]。有机溶剂能断裂秸秆内部木质素与纤维素之间的酯键，增大葡萄糖产率[16]，还可通过减压蒸馏进行回收，降低成本，且提取的木质素纯度高，可避免阻碍微生物生长、酶法水解和发酵的化合物生成[17]。Neilson等使用乙醇预处理来脱除木质素，可以提高木材的酶解率[18]。虽然各种预处理方法各有优势，但单一的预处理方式有局限性，文献中也多次报道组合试剂法，Dai等采用NaOH、尿素对水稻秸秆预处理，发现其有协同效应，明显提高了糖产率[19]。He等用离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐与NaOH处理玉米秸秆，酶促水解 2 d，生物质转化成还原糖的产率为95.1%[20]。基于溶剂法和碱法的各自优势，尝试选用复合溶剂法进行葵花秆的预处理。本研究选用NaOH、乙醇复合溶剂对葵花秆进行预处理，研究预处理时间、温度、固液比、碱醇比以及碱和乙醇浓度对木质素去除率的影响，并通过正交试验确定最佳条件，比较复合溶剂与单溶剂预处理对葵花秆酶解制糖的影响，以期提高木质素的去除率，进一步提高酶解制糖产率。

1材料与方法

1.1材料及仪器

材料：葵花秆取自陕西省神木县，用粉碎机粉碎后过 40～80目筛，主要成分如下：水分12.51%、综纤维素4884%、木质素13.26%、灰分4.24%；纤维素酶来源于黑曲霉（载体为淀粉），粉末，购自于阿拉丁公司；氢氧化钠、无水乙醇、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、柠檬酸钠、柠檬酸、盐酸、丙酮、硫酸均为分析纯。

仪器：恒温油浴锅（DF-101S型），离心机（SK-1型），恒温水浴振荡器（DKZ系列），鼓风干燥箱（101-3型），旋转蒸发器（RE-2000B型），电子天平（FA-2004型），双光束紫外可见分光光度计（TU-1901型），马弗炉（XSI-25-1200型），傅里叶红外光谱仪（EQUINOX55型），扫描电镜（JSM 6460 LV型）。

1.2葵花秆预处理

取一定量葵花秆，在鼓风干燥箱中烘干至恒质量。取2 g葵花秆置于三口烧瓶中，加入预处理液，在一定温度下反应一段时间。反应结束冷却至室温后抽滤，用超纯水将滤饼洗涤至中性，收集滤液、滤饼。滤饼在105 ℃下烘干至恒质量。滤液用旋转蒸发仪减压蒸馏，回收乙醇，然后在滤液中加入浓硫酸使木质素析出沉淀，最后回收木质素，木质素去除率计算方法如下：

[JZ（]木质素去除率=[JB（（]1-[SX（]溶剂法处理后木质素质量葵花秆中木质素质量[SX）][JB））]×100%。[JZ）][JY]（1）

1.3滤纸酶活力的测定

参照QB 2583—2003《纤维素酶制剂》的方法配制DNS试剂、柠檬酸缓冲液、葡萄糖标准贮备溶液（10 mg/mL）及葡萄糖标准使用溶液，绘制葡萄糖标准曲线。参照QB 2583—2003《纤维素酶制剂》的方法，制备待测酶样和滤纸条，利用下式计算滤纸酶活力：

[JZ（]X1=A×1/0.5×n。[JZ）][JY]（2）

式中：X1为滤纸酶活力（FPA）；A为由测得吸光度计算的还原糖量；1/0.5为酶液的稀释倍数。

1.4酶解试验

分别取50 mg未经处理的葵花秆、经2% NaOH溶液处理、经70%乙醇溶液处理、经2% NaOH溶液和70%乙醇溶液协同处理的葵花秆各4组，共16组于试管内，对其进行编号。在每只试管中加入一定量柠檬酸缓冲液和90 U/g的纤维素酶，混匀，盖塞，置于50 ℃的恒温水浴振荡器中酶解，每隔 12 h 各取4种原料中的1支试管，加入DNS试剂，在沸水浴中加热10 min使酶失活。然后在冷水浴中使其降到室温，加水至25 mL混匀，使用双光束紫外可见分光光度计测定溶液在波长540 nm下的吸光度，将该吸光度代入标准葡萄糖曲线的线性回归方程，计算出葡萄糖产量。

2结果与分析

2.1各因素对葵花秆木质素去除率的影响

2.1.1水解温度、水解时间对木质素去除率的影响

水解温度选择：称取2 g葵花秆，加入90%乙醇、2% NaOH复合溶剂（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，分别在140、150、160、170 ℃下水解 1 h，测其木质素去除率。如图1-a所示，随着温度升高，木质素去除率不断提高，但是当温度进一步提高时，木质素去除率上升缓慢。说明随着温度升高，预处理反应越来越剧烈，温度到160 ℃时反应剧烈程度趋于饱和，所以木质素去除率的上升速率变慢。

水解时间选择：称取2 g葵花秆，加入90%乙醇、2% NaOH复合溶剂（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下，分别水解0.5、1.0、1.5、2.0 h，测其木质素去除率。如图1-b所示，随着处理时间延长，木质素去除率呈现迅速增大而后趋于平缓增长的趋势。处理时间越长，木质素去除率越高。当处理时间超过1.5 h后，反应液中的木质素含量趋于饱和，时间过长可能会阻止木质素的继续溶出。

2.1.2溶剂质量分数、体积分数对木质素去除率的影响

乙醇体积分数选择：称取2 g葵花秆，分别加入60%、70%、80%、90%乙醇和2% NaOH的复合溶剂（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下水解1 h，测其木质素去除率。如图2-a所示，随着乙醇浓度增大，木质素去除率先升高后降低，当乙醇体积分数为70%时，木质素去除率最高。这与有机溶剂乙醇破坏了木质素之间的连接键、半纤维素之间的糖苷键以及木质素和半纤维素之间的醚键、4-O-甲基葡萄糖醛酸酯键，加速木质素的溶出有关，所以乙醇体积分数不宜过高或过低，结合实际生产成本，选择乙醇体积分数为70%。

[JP+1]NaOH质量分数选择：称取2 g葵花秆，分别加入70%乙醇和0.5%、1.0%、2.0%、3.0% NaOH的复合溶剂（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1） 40 mL，在160 ℃下水解1 h，测其木质素去除率。如图2-b所示，随着NaOH浓度增大，木质素去除率不断上升，但是上升趋势不断减缓。氢氧化钠导致木质素膨胀、纤维素内表面积增加以及聚合度和结晶度降低，从而引发木质素结构的断裂，考虑到实际成本，选择NaOH溶液浓度为2.0%。

2.1.3固液比和复合溶剂体积比对木质素去除率的影响

固液比选择：称取2 g葵花秆，分别加入70%乙醇、2% NaOH复合溶剂（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）30、40、50、60 mL，在160 ℃下水解 1 h，测其木质素去除率。如图3-a所示，随着固液比的增加，木质素去除率先升高后缓缓下降。由于乙醇可以溶解木质素，因此增大固液比有利于木质素的溶出，但到一定程度就会饱和。当固液比为1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL）时，木质素去除率最高。

乙醇与NaOH体积比的选择：称取2 g葵花秆，分别加入70%乙醇、2% NaOH复合溶剂（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]0、2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2、0 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下水解1 h，测其木质素去除率。如图3-b所示，单独用2种溶液进行预处理时，木质素去除率很低；当2种溶液进行复合处理时，木质素去除率有较大提升，说明复合溶剂有协同作用，当乙醇溶液与NaOH溶液体积比为1 ∶[KG-*3]2时，木质素去除率最高。

2.1.4正交试验

根据单因素试验结果，分别将NaOH浓度、乙醇浓度确定为2%、70%，将考察因素定为温度、时间、复合溶剂（2% NaOH、70%乙醇）比例、固液比，采用L9（34）正交表进行试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。

由表2可知，4个因素对葵花秆木质素去除率影响大小次序为时间>复合溶剂体积比>固液比>温度。优化得到的最佳条件为A3B2C1D1，即加热温度170 ℃，时间1 h，2% NaOH、[JP2]70%乙醇体积比2 ∶[KG-*3]1，固液比为1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL）。使用该最优条件进行试验验证，得到的木质素去除率为 53.75%，高于表2中所有结果，验证了正交试验结果的正确性。

2.2葵花秆预处理前后的结构变化

2.2.1红外光谱分析

从图4可以看出，水解前后的葵花秆红外谱图基本相似，3 370 cm-1为分子内羟基O—H伸缩振动谱带，2 920 cm-1为—CH、—CH2伸缩振动的吸收峰，波数 1 720～1 733 cm-1处的吸收峰表征与木质素或半纤维素有关的非共轭酮基、羰基及酯键的C[FY=，1]O伸缩振动[21]，1 650 cm-1处的吸收峰由木质素中共轭羰基伸缩振动所导致[22]。经预处理后，发现其特征吸收峰基本消失不见，说明木质素的结构被破坏，1 510 cm-1為木质素苯环骨架振动的特征吸收峰，经预处理后也基本消失，说明脱出了木质素。1 250 cm-1愈创木基的苯环伸缩振动引起，1 060～1 062 cm-1为葵花秆的中纤维素与半纤维素的特征光谱带，897 cm-1为纤维素中 β-D-葡萄糖苷的特征峰[23-24]，预处理的特征峰与原样品相比有了更明显的变化，这可能是因为经过碱和有机溶剂协同预处理，断裂了木质素与半纤维素间的连接键，使部分木质素得以去除。消除了木质素的包裹，纤维素和半纤维素暴露出来的部分越来越多，所以其特征峰更加明显。

2.2.2掃描电镜分析

在植物细胞壁中，纤维素被木质素伸展蛋白、半纤维素、果胶质组成的基质所包埋，这样可以增强植物细胞壁的抗拉强度和机械性能，所以在图5-a中所看到的葵花秆结构致密，纤维素紧密排列在一起，高度有序。如图5-b所示，经过氢氧化钠、乙醇复合溶剂预处理后，葵花秆结构被破坏，表面出现不规则的裂痕和孔洞、褶皱，大量木质素被降解，木质素与半纤维素之间的空间立体交联结构被破坏，内部纤维素骨架显现，暴露出更多纤维素[25]，比表面积增大，纤维素酶与纤维素的接触面增加，增大了酶解制糖的产率。

2.3不同预处理方法对葵花秆酶解制糖的影响

以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线（图6），回归方程为y=0.229 2x+0.009 6，线性回归系[CM（25]数为r2=0.999[KG*3]01。通过测定分析得出，本试验所用的纤维素滤纸酶活力为546 U/g。

以未处理的葵花秆、经过2% NaOH预处理的葵花秆、70%乙醇预处理的葵花秆、2% NaOH和70%乙醇协同预处理的的葵花秆为原料进行酶解试验。由图7可知，所有曲线都呈上升趋势，并且上升速率越来越小。未经过预处理的葵花秆相关曲线上升幅度和速率都最小，可能是由于木质素的阻挡，酶与纤维素接触受阻，酶解率也低。对于单溶剂来说，利用2% NaOH处理的葵花秆，其葡萄糖产率比70%乙醇处理的葵花秆稍高一些，这是由于2% NaOH预处理葵花秆时，其木质素脱除率略高于70%乙醇溶剂。用2% NaOH、70%乙醇共同预处理葵花秆，其葡萄糖产率明显比单一溶剂预处理的效果好，这是由于用混合溶剂预处理葵花秆时，木质素的脱除率最高。

[FK（W13][TPHBB7.tif][FK）]

3结论

本研究表明，2% NaOH、70%乙醇复合溶剂预处理葵花秆时，木质素去除率显著高于2%氢氧化钠或70%乙醇溶剂单独处理；通过正交试验优化后的最佳预处理条件是：加热温度170 ℃，时间1 h，2% NaOH溶液、70%乙醇体积比为2 ∶[KG-*3]1，固液比为1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL），该条件下木质素去除率为 53.75%；葵花秆预处理后，其木质素去除率越高，酶解后葡萄糖的产率越高。

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