史文军++万夕和++陈海泉 乔毅 +沈辉 +王李宝++黎慧

摘要：以脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda Holthuis）为试验材料，以人工连续7 d投喂携带白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的死虾为攻毒方式，得抗性试验组（Rm）；以人工连续7 d投喂不携带WSSV的死虾为对照方式，得对照试验组（Vm），待存活率稳定后，分析比较抗性试验组和对照试验组的存活率及酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）活性的差异性；然后待Rm组中雌性脊尾白虾虾卵接近孵化时，挑选40～50尾体格较大的抱卵雌虾，分别放入事先准备好的桶中，让其自然孵化，以此得Rm1代；孵化完成后，收集各组亲虾并编号，用套式PCR法检测各组亲虾WSSV携带情况，将阴性组及虾卵孵化较少组淘汰，留下20组，重新编号Rm1代，然后将其喂养成成虾；以此方式连续选育得到Rm3代。用同样方法对Rm3代成虾和自然环境中WSSV携带成虾（Vn）进行攻毒试验，然后检测结果显示Rm3代成虾比Vn成虾存活率要高出很多且免疫相关酶活性之间存在显著性差异。

关键词：脊尾白虾；白斑综合征病毒；抗病群体；免疫相关酶

中图分类号： S945.4+99文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0126-03

我国是虾类养殖大国，但是随着养殖业的快速扩张，养殖环境恶化、种苗退化和病害高发等因素严重制约了产业的发展[1-2]。其中，虾类病害越来越严重，白斑综合征（white spot syndrome，WSS）的暴发给虾类养殖带来严重损失，这种病毒在虾类个体间可以经口传播，虾类感染后，死亡率极高[3-6]。因此选育出具有一定抗性的群体及对相关免疫酶活性的研究具有重要意义。虾类主要依靠非特异性免疫系统进行自身的免疫防御，其中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）常被用于衡量虾类的免疫状态、健康状态以及筛选抗病家系等[7-9]。

脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda Holthuis）属于甲壳亚门十足目长臂虾科白虾属，其环境适应力强、世代周期短且易于人工条件下周年繁殖，是我国常见虾类养殖经济品种[10]。另一方面，脊尾白虾对WSSV敏感性强，在养殖过程中感染WSSV后死亡率极高，容易造成严重的养殖损失。本研究以脊尾白虾为试验材料，通过投喂携带WSSV的死虾为攻毒方式，连续进行3代选育；并分析抗性试验组与对照试验组存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差异，探讨初步选育具有一定抗WSSV的脊尾白虾群体并研究相关免疫酶的活性变化。

1材料与方法

1.1试验动物和病毒携带虾来源

试验所用脊尾白虾：2014年3月于江苏省东台市脊尾白虾养殖区选取经套式PCR法检测WSSV携带情况为阴性池塘内的虾，体长为（4.8±0.5） cm，体质量为（1.9±0.4） g；

试验用病毒携帶死虾：2013年6月于江苏省东台市脊尾白虾养殖区选取大规模死亡后经套式PCR法检测WSSV携带情况为阳性池塘内的虾，迅速冷藏运回实验室，并存储于-80 ℃冰柜中待用；

试验用自然环境病毒携带虾：2015年6月于江苏省东台市脊尾白虾养殖区选取经套式PCR法检测WSSV携带情况为阳性虾塘内的活体成虾，平均体长为（5.1±0.3） cm，平均体质量为（2.1±0.5） g。

1.2WSSV攻毒试验

1.2.1抗WSSV群体的获得将试验用脊尾白虾用活水车运输至江苏省海洋水产研究所吕四养殖试验基地，按约5 ∶[KG-*3]1分为试验组和对照组（1 000尾 ∶[KG-*3]200尾），适应性暂养 7 d，期间正常投喂事先检测不携带WSSV的颗粒饵料并及时捞出死虾及残饵，待两组虾稳定后；向试验组投喂携带WSSV的死虾，向对照组投喂不携带WSSV的死虾，每日早晚各投喂1次并及时捞出残饵及死虾，根据前日残饵量及时调整投喂量，连续投喂7 d，得到0代试验组（Rm0）和对照组，以后按正常的管理方法进行换水和投喂颗粒饵料。每天观察虾的存活情况，及时捞出并记录死虾数量，待试验组虾存活情况稳定后，分析比较试验组和对照组的存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差异性；然后待Rm0组中雌性脊尾白虾虾卵接近孵化（虾卵成亮白色，黑色眼点明显可见）时，挑选40～50尾体格较大抱卵雌虾，分别放入事先准备好的桶中，让其自然孵化，以此得Rm1代；孵化完成后，收集各组亲虾并编号，用套式PCR法检测各组亲虾WSSV携带情况，将阴性组及虾卵孵化较少组淘汰，留下20组，重新编号Rm1代，然后将其喂养成成虾；按以上方法连续攻毒选育得到Rm3代。

1.2.2攻毒对Rm3和Vn的影响比较[JP2]为检验经历WSSV连续感染淘汰后，Rm3代脊尾白虾成虾是否比自然环境中病毒携带虾（Vn）的抗性强，并检测相关免疫酶活性变化情况，进行如下试验：从20组Rm3代脊尾白虾成虾中随机挑选150尾，并随机分为3组，每组50尾；另外随机挑选Vn组脊尾白虾成虾150尾，随机分为3组，每组50尾。向6组中分别投喂携带WSSV的死虾，每日早晚各投喂1次并及时捞出残饵，根据前日残饵量及时调整投喂，连续投喂7 d，以后按正常的管理方法进行换水和投喂颗粒饵料。每天观察虾的存活情况，及时捞出并记录死虾数量，待虾存活情况稳定后，分析比较Rm3代组和Vn组的存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差异性。[JP]

1.3WSSV携带情况检测

为检测脊尾白虾WSSV携带情况，本试验采用套式PCR法，具体操作过程参照GB/T 28630.2—2012《白斑综合征（WSD）诊断规程第2部分：套式PCR检测法》。

1.4总蛋白质的提取及酶活检验

[JP2]将所取脊尾白虾的头胸部取下作为样品，于液氮中进行研磨至均匀细致的粉末，用于相关免疫酶活性检测[10]。酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，分别按试剂盒使用说明书检测脊尾白虾中免疫相关酶活性。研磨细碎的粉末中总蛋白的含量采用Bradford法[11]测定。[JP]

1.5数据处理

所有数据均采用平均值表示，且每组不少于3个平行，采用SPSS软件对数据进行分析，若P<0.05，表示试验组与对照组之间存在显著性差异。

2结果与分析

2.1脊尾白虾耐受群体的获得

脊尾白虾抗WSSV群体由Rm0代到Rm3代共经历3次攻毒，每次攻毒后，试验组脊尾白虾均出现大批量死亡，对试验组和对照组的死虾采用套式PCR法进行WSSV携带情况检测，结果显示抗性试验组死亡的脊尾白虾随机抽样都检测到WSSV阳性，说明其死亡原因可能由WSSV感染所致；而对照组死亡的脊尾白虾随机抽样都未检测到WSSV，说明其死亡原因并非WSSV感染所致。

2.2Rm0～Rm2代及Vm群体存活率和免疫相关酶活性差异

通过统计计算每次攻毒至稳定后Rm0～Rm2代和Vm的脊尾白虾存活率，结果见图1。Vm中脊尾白虾平均存活率达到91.60%，而Rm0脊尾白虾几乎完全死亡，平均存活率只有6.07%；Rm2中脊尾白虾存活率略有提高，达到1260%，[JP2]Rm0～Rm2代和Vm的存活率均存在显著性差异（P<005）。[JP]

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利用酶活检测试剂盒对每次攻毒至稳定后Rm0～Rm2代和Vm的脊尾白虾ACP、AKP、SOD和PO的活性进行检测，结果见图2。由图2可以看出随着攻毒次数的增加，4种免疫相关酶在脊尾白虾体内的酶活力均呈下降趋势，其中ACP和PO的下降趋势明显、AKP下降趋势次之、SOD下降趋势最弱；但随着攻毒次数的增加，Rm2代脊尾白虾体内4种免疫相关酶活力均显著低于Vm中的酶活（P<0.05）。

2.3攻毒后Rm3及Vn群体存活率和免疫相关酶活性差异

参照上述的试验方法及检测方法，分析比较Rm3和Vn群[CM（25]体在攻毒后的差异性，结果见图3。由图3可以看出经过WSSV连续攻毒选育后得到的Rm3比Vn 对经口感染WSSV的耐受力要高；4种免疫相关酶ACP、AKP、SOD和PO在Rm3和Vn之间均存在显著性差异（P<0.05）。

3讨论

虾类抗病群体或家系选育研究是目前国际上良种选育的重要方向。在我国，对虾类抗病群体或家系选育研究也较为普遍，如朱其建等进行了抗溶藻弧菌罗氏沼虾群体的选育[12]、黄永春等进行了抗WSSV凡纳滨对虾家系的选育[13-14]以及王专伟[15]和张涛[16]进行了抗WSSV斑节对虾家系的选育等。本研究以人工感染的方式对脊尾白虾进行了连续3次攻毒，将其中低耐受力个体淘汰，最终存活下来的群体被认为是对WSSV具有高耐受力的脊尾白蝦群体；对Rm3和Vn[JP2]群体在攻毒后的差异性比较结果也进一步说明了这一选育方法的可靠性。当然，想要最终得到一种高抗WSSV的脊尾白虾新品种，选育的世代仍需继续延续下去，但这种抗性能否稳定遗传仍需要通过分子生物学手段分析其进化关系来确定。[JP]

甲壳类动物主要依靠非特异性免疫系统进行免疫防御，其中免疫蛋白质起到至关重要的作用。Chen等[17]、Sung等[18]和Qin等[19]的研究中均将ACP和AKP用作免疫能力变化的相关指标；在Fridovich[20]和Johansson等[21]的研究中分别将SOD和PO作为免疫能力变化的相关指标。本研究中，选取ACP、AKP、SOD和PO这4种免疫相关酶作为脊尾白虾攻毒稳定后，体内免疫能力变化的指标。由Rm0代到Rm2代，4种免疫酶活力均呈现下降趋势，这与王专伟等[9]、冯宁宁等[10]、[JP2]张涛[16]和张曼等[22]研究WSSV对不同种虾类免疫酶活性的影响相似；但在本试验中，虽然Rm2代4种免疫酶最终与Vm均存在显著性差异，但ACP、AKP和PO的变化趋势更为显著，而SOD的变化趋势较小；所以在脊尾白虾对WSSV抗性强弱方面，ACP、AKP和PO这3种免疫相关酶活性的高低更具有指示性；但是否能真正作为脊尾白虾对感染WSSV的主要免疫指标还需进行更加深入的研究。在Rm3代与Vn存活率及免疫相关酶活性比较分析中可以看出，经过连续的攻毒选育，Rm3代成虾比Vn成虾对WSSV的抗性有所提高，免疫相关酶活性的变化也与前期研究具有一致性。[JP]

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