金娜++卢修亮++刘倩++简恒+��

摘要：通过室内及盆栽试验测定红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液对小麦全蚀病的防治效果。室内试验结果表明，红灰链霉菌HDZ-9-47发酵滤液可抑制小麦全蚀病的菌丝生长，稀释5、10、20、50、70、100、150、200倍的发酵滤液对菌丝生长抑制率分别为100%、95%、88%、77%、51%、40%、38%、28%。红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液浸种3 h对小麦发芽率无影响。盆栽试验结果表明，发酵液2次灌根处理可防治小麦全蚀病，在2012—2013年2次盆栽试验中的防效分别为55%和41%。说明红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液对小麦全蚀病有较好的防治效果，具有开发为生防制剂的潜力。

关键词：红灰链霉菌；小麦全蚀病；生物防治；防治效果

中图分类号： S435.121.4+9文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0083-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2016-01-11

基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201503114）。

作者简介：金娜（1985—），女，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，主要从事南方根结线虫生防菌研究。E-mail：heidakingner@126.com。

通信作者：简恒，教授，博士生导师，主要从事植物病原线虫研究。Tel：（010）62731102；E-mail：hengjian@cau.edu.cn。[HJ]

小麦全蚀病是由禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var. tritici）侵染引起的一种毁灭性病害，在世界范围内广泛分布[1]。我国20世纪30年代首次在浙江省发现该病，近年来该病的发病面积和危害日益加重，已蔓延至华东、华北、西北地区的19个省，其中河南、山东和安徽等省份发生尤为严重。全蚀病从小麦苗期开始危害，造成苗期叶片发黄，麦苗生长缓慢，在成熟期引起植株大片枯死，造成小麦减产20%～50%，甚至绝收[2-3]。目前，抗小麦全蚀病的品种较少，轮作倒茬在小麦大面积种植区的应用存在局限性，化学防治易造成抗药性且污染环境[4]。因此，筛选有效防治小麦全蚀病的生防制剂势在必行。

自从1934年美国和英国发现小麦全蚀病的抑制性土壤以来，生物防治便成为防治该病的一项重要措施[5]。研究发现，小麦根际的荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）通过产生抗生素（2，4-diacetylphloroglucinol，2，4-DAPG）在小麦全蚀病自然衰退土壤中发挥着主要作用[6]。目前国内外都在开发利用荧光假单胞杆菌来防治小麦全蚀病，Yang等从河南省和江苏省的小麦根际土壤中分离得到105株对小麦全蚀病具有抑制效果的假单胞菌[7]。除了荧光假单胞菌外，研究人员还发现芽孢杆菌（Bacillus）、木霉菌（Trichoderma）、青霉菌（Penicillium）和芽枝霉（Cladosporium）等对小麦全蚀病有抑制作用[8]，但这些生防菌易受环境影响，防效不稳定，大规模应用很少，因此目前亟需筛选受环境因素影响小的生防因子[9]。放线菌中的链霉菌因其可以产生大量生命力强的孢子来抵御外界环境影响，而被广泛应用于农业病害防治。目前放线菌的活体制剂Mycostop（Streptomyces griseovirdis K61）和Actinovate Soluble（Streptomyces lydicusstrain WYEC 108）等已被登记注册为生物农药，用于防治镰刀菌属（Fusarium）、腐霉菌属（Pythium）、疫霉菌属（Phytophthora）等多种常见土传病害[10]，但应用链霉菌防治小麦全蚀病却鲜有研究报道。本研究评价了红灰链霉菌（S. rubrogriseus）HDZ-9-47对小麦全蚀病的防治效果，以期为小麦全蚀病的生物防治提供新方法。

1材料与方法

1.1供试菌株

红灰链霉菌菌株HDZ-9-47，是从根结线虫卵上分离得到的，由中国科学院微生物研究所真菌系统学及生物学研究室提供，保存于中国普通微生物菌种保藏中心（保藏编号为CGMCC 2878）。

1.2小麦全蚀病菌

小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）由中国农业大学张立群教授提供。

1.3供试培养基

高氏1号培养基：可溶性淀粉20 g/L、NaClO 5 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、琼脂20 g/L、pH值为7.3[11]。

发酵培养基：玉米粉16.5 g/L、豆饼粉10 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、NH4NO3 1 g/L、CaCO3 1 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MnSO4 0.338 g/L、pH值为7.3[12]。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL[11]。

玉米粉砂培养基：按玉米粉 ∶[KG-*3]沙 ∶[KG-*3]水为1 ∶[KG-*3]1 ∶[KG-*3]0.5的比例混合均匀，蒸煮1 h，冷却后切成小块，再装入三角瓶中，每瓶约装容量的1/3，121 ℃灭菌90 min，灭菌后趁热摇匀，以免冷却后结块[13]。

1.4供试小麦品种

豫麦49号，由河南农业大学李洪连教授提供。

1.5HDZ-9-47发酵液及发酵滤液的制备

孢子悬浮液的制备：将保存在菌种管中的红灰链霉菌HDZ-9-47在高氏1號培养基平板上活化培养7 d后，在无菌超净台中，用无菌刀刮下培养板上的菌丝和孢子，悬浮于装有4 mL无菌水的50 mL离心管中，在振荡器上充分振荡，制成孢子悬浮液。用血球计数板在显微镜下计算孢子数，调整终浓度为0.1亿个孢子/mL[12]。

发酵液的制备：在无菌超净台中，用1 mL移液枪（Eppendrof，美国）吸取1 mL新制备的HDZ-9-47孢子悬浮液接入装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃，160 r/min 培养72 h[12]。

发酵滤液的制备：将发酵液置于离心管中，12 000 r/min 离心20 min，取上清液，用0.22 μL细菌过滤器过滤除去菌体。

1.6菌丝生长抑制率

采用菌丝生长速率法测定红灰链霉菌HDZ-9-47发酵滤液对小麦全蚀病菌的抑菌活性[14]。用融化的PDA培养基（55 ℃左右）将发酵滤液按体积比分别稀释5、10、20、50、70、100、150、200倍，倒入直径9.0 cm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌水的PDA平板为对照，再将直径为5 mm的小麦全蚀病菌菌饼置于平板中央，于28 ℃下培养7 d，用十字交叉法测量小麦全蚀病菌菌落生长直径，重复3次，根据公式（1）、（2）计算菌丝生长抑制率。

[JZ（]菌落直径=测量直径-菌饼直径；[JZ）][JY]（1）

[HS2][HT9.，8.5]菌丝生长抑制率=[SX（]对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径[SX）]×100%。[JY]（2）[HT〗

1.7HDZ-9-47对小麦发芽率的影响

挑选大小一致，饱满的小麦种子，用5% NaClO消毒 10 min，用无菌水冲洗3次后分别置于500 mL烧杯中。在烧杯中分别用发酵原液、10倍稀释液、50倍稀释液浸种3 h。将小麦种子腹沟向下整齐排列在铺有湿滤纸的培养皿中，每皿40粒。以清水为对照，置于自然条件下培养萌发。分别在1、2、3、4、7 d计算种子发芽数，以胚根突破种皮为准[15]。根据公式（3）计算小麦种子发芽率。

[HS2][JZ（]发芽率=[SX（]发芽率种子总数[SX）]×100%。[JZ）][JY]（3）

1.8小麦全蚀病菌的扩繁

在无菌条件下，将PDA平板边缘生活力较强的菌饼（直径0.8 cm）移入装有玉米粉、沙的培养基的三角瓶中，每瓶5块菌饼。然后置于25 ℃下恒温培养，待菌丝长满时，平行摇动1次，使菌丝体均匀生长，半个月后取出阴晾，备用[16]。

1.9HDZ-9-47对小麦全蚀病的防治效果

2012—2013年在盆栽试验中评价施用红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液对小麦全蚀病的防治效果。将扩繁的小麦全蚀病菌与灭菌土按1 ∶[KG-*3]100的比例混匀，然后装入20 cm的塑料盆中[16]。在播种前分别进行以下处理：（1）麦种经发酵液浸种3 h后播入钵中，以带菌土盖之（浸种）；（2）麦种经发酵液浸种3 h后播入钵中，以带菌土盖之，小麦进入返青期后，再用200 mL发酵液灌根（浸种+灌根）；（3）小麦播种后，用200 mL发酵液灌根（灌根）；（4）小麦播种后，用 200 mL 发酵液灌根，返青期后，再用200 mL发酵原液灌根（灌根+灌根）；（5）2%戊唑醇湿拌剂1 ∶[KG-*3]500拌种；（6）空白对照。每处理5盆，每盆20粒。分别在小麦灌浆期和收获期按照以下分级方法和公式（4）、（5）调查发病情况和计算防效。

分级标准：0级，无病；1级，变黑根面积占根总面积的5%以下；2级，变黑根面积占根总面积的6%～10%；3级，变黑根面积占根总面积的11%～25%；4级，變黑根面积占根总面积的26%～40%；5级，变黑根面积占根总面积的41%～65%；6级，变黑根面积占根总面积的66%～100%[17]。

[HS2][JZ（]病情指数=∑[JB（（][SX（]病级株数×该级代表数值调查总株数×发病最高一级的代表数[SX）][JB））]×100；[JZ）]

[JY]（4）[HT〗

[HS2][JZ（]防效=[SX（]对照病情指数-处理病情指数对照病情指数[SX）]×100%。[JZ）][JY]（5）

1.10数据分析

试验数据用Excel进行数据统计与作图，利用SPSS 19.0统计软件进行方差分析，并采用Tukey多重比较法（P<0.05）进行差异显著性检验。

2结果与分析

2.1HDZ-9-47对小麦全蚀病菌的菌丝生长抑制率

由图1可知，发酵滤液稀释5、10、20、50、70、100、150、200倍均能抑制小麦全蚀病菌菌丝的生长，菌丝生长抑制率分别为100%、95%、88%、77%、51%、40%、38%、28%。结果表明[CM（25]，红灰链霉菌HDZ-9-47发酵滤液对小麦全蚀病菌有较[CM）]

[FK（W10][TPJN1.tif][FK）]

强的抑制作用，具有在盆栽试验中防治小麦全蚀病的潜力。

2.2HDZ-9-47发酵液对小麦发芽率的影响

为考察在盆栽或田间应用时，是否可以用HDZ-9-47发酵液对小麦种子进行浸种处理以防治小麦全蚀病，本研究采用浸种法研究红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液对小麦出芽率的影响。将小麦种子分别在红灰链霉菌HDZ-9-47发酵原液、10倍、50倍稀释液及无菌水中浸种3 h，结果如图2所示，浸泡在稀释10倍发酵液中的小麦种子，在1、2 d发芽率低于对照水处理（P<0.05），但是3、4、7 d的发芽率与对照无显著差异。发酵原液和稀释50倍的发酵液在1、2、3、4、7 d均对小麦发芽率无显著性影响。浸种后7 d，所有处理中的小麦发芽率都在80%以上。结果表明，发酵液浸种对小麦发芽率无影响，在田间可以应用发酵液浸种法处理小麦种子。该研究结果为应用红灰链霉HDZ-9-47发酵液在田间防治小麦全蚀病奠定了基础。

2.3HDZ-9-47对小麦全蚀病的防治效果

2012年盆栽试验中用红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液按4种不同的施用方法处理小麦。在灌浆期取样调查结果（图3）显示，除了单独用红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液浸种处理外，发酵液其他处理均能显著降低小麦全蚀病的发病级数（P<0.05）。对照的发病级数为1.89，而发酵液2次灌根、浸种后再灌根、单独灌根处理的发病级数仅为0.59、059、0.88，防效分别为69%、69%、54%，其中浸种后灌根和2次灌根的防效显著高于单独灌根处理（P<0.05）。化学农药戊唑醇的发病级数为0.1，防效达95%。在收获期调查取样结果显示，所有处理均能显著降低小麦全蚀病的发病级数（P<0.05）。发酵液2次灌根的发病级数为0.83，防效为55%，浸种后灌根处理的发病级数为1.0，防效达46%，化学农药戊唑醇的防效达74%。由此可见，红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液2次灌根可在一定程度上防治小麦全蚀病。[FL）]

[FK（W12][TPJN3.tif][FK）]

2013年盆栽试验结果（图4）显示，在灌浆期所有处理都能显著降低小麦全蚀病的发病级数（P<0.05）。对照的发病级数为5.6，化学农药戊唑醇处理的发病级数最低，为 2.6。浸种后再灌根、2次灌根处理中的发病级数分别为 3.3、3.4，显著低于单独浸种或1次灌根的4.5和4.2（P<0.05）。防效为化学农药戊唑醇54%>浸种后灌根41%>2次灌根39%>灌根25%>浸种19%（P<0.05）。在收获期，对照的发病级数为5.9，所有处理都能显著降低小麦全蚀病的发病级数（P<0.05）。化学农药戊唑醇、2次灌根处理的发病级数均为3.5，显著低于单独灌根、浸种后灌根、单独浸种的45、4.9、4.8（P<0.05）。各处理的防效为戊唑醇41%=2次灌根41%>灌根25%>浸种19%>浸种后灌根17%。由此可见，红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液2次灌根处理防治小麦全蚀病的效果与化学农药戊唑醇相当。

2012—2013年2次盆栽试验结果均表明，用红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液分别在小麦播种期和返青期灌根可防治小麦全蚀病的发生，红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液具有用于田间防治小麦全蚀病的潜力。

3结论与讨论

小麦是我国的主要粮食作物，近年来种植面积达2 400万hm2左右，病虫害是影响其稳产、高产的主要原因。据统计，我国小麦上常见病虫害有70多种，每年因病虫害损失小麦25亿～30亿kg，发生普遍、危害严重的病害主要有小麦条锈病、纹枯病、全蚀病、根腐病、孢囊线虫病等，这些病害常常发生复合侵染，从而造成作物更严重的产量损失[18-19]。据Smiley等报道，作物被植物寄生线虫侵染后更容易被其他土传真菌病害侵染， 例如落选短体线虫（Pratylenchus neglectus）[FL）]

[TPJN4.tif][FK）]

单独侵染小麦时，小麦产量损失8%～36%，但是当落选短体线虫、小麦孢囊线虫（Heterodera avenae）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani AG-8）、小麦全蚀病菌共同侵染小麦时，小麦产量损失高达71%[19]。因此，筛选出具有广谱活性的生防菌对我国小麦生产的可持续发展具有重要意义。

链霉菌用于防治植物病害已有较多报道，但是用于防治小麦全蚀病却鲜有报道[20]。红灰链霉菌HDZ-9-47是从根结线虫卵上分离得到的，前期的室内试验结果表明，红灰链霉菌HDZ-9-47對小麦孢囊线虫2龄幼虫的致死率达44%。本研究在室内及盆栽试验中评价了红灰链霉菌 HDZ-9-47对小麦全蚀病的防治效果，结果显示在室内红灰链霉菌HDZ-9-47发酵滤液对小麦全蚀病菌具有较强的抑菌活性。在2012—2013年的盆栽试验中，发酵液2次灌根对小麦全蚀病菌的防效分别为55%和41%，其防效和化学农药戊唑醇的防效相当，说明红灰链霉菌HDZ-9-47具有开发为生防制剂在田间防治小麦全蚀病的潜力。2012年小麦全蚀病的发病级数较低，因此2012年各处理的防效均高于2013年，但无论是在小麦全蚀病发病严重的情况下还是在较轻的情况下，施用红灰链霉菌 HDZ-9-47发酵液都可防治小麦全蚀病的发生。综上所述，红灰链霉菌HDZ-9-47对危害小麦的孢囊线虫病和小麦全蚀病都有抑制效果，如果在田间施用红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液可以同时防治这2种病害，那么对小麦的生产会有十分重要的应用价值，因此下一步还将继续研究红灰链霉菌HDZ-9-47发酵液对小麦孢囊线虫和小麦全蚀病的田间防治效果，以期研究开发出同时防治2种病害的高效生防制剂。

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