张晓波 翟晓朦 许沛东++赵艳

摘要：根据正交试验设计原理探索野牛草[Buchloe dactyloides（Nutt.） Engelm.]ISSR-PCR反应体系中各主要成分的最优化用量，对影响野牛草ISSR-PCR反应体系的主要因素[dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物（Primers）、Mg2+的用量]进行优化，获得野牛草的ISSR-PCR最适反应体系为20 μL的反应体系，包括引物（2.0 μmol/L）4.0 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.6 μL、dNTP（2 mmol/L）2.0 μL和模板DNA（20 ng/μL）3.0 μL。该优化体系的建立为利用ISSR分子标记进行野牛草种质资源遗传多样性研究、种质资源鉴定等奠定了基础。

关键词：野牛草；ISSR-PCR；反应体系；正交优化

中图分类号：S688.401文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0033-03

收稿日期：2015-10-06

基金项目：海南大学青年基金（编号：qnjj1149）。

作者简介：张晓波（1978—），男，山西岢岚人，博士研究生，副教授，从事草坪管理相关研究，E-mail：angiaoo@126.com。

通信作者：赵艳。E-mail：yanbo315@126.com。

野牛草[Buchloe dactyloides （Nutt.） Engelm.]为禾本科（Gramineae）画眉草亚科（Eragrostoideae）野牛草属（Buchloe）多年生草本植物，由于植株低矮、易繁殖、蔓延快且具有极强的抗旱性，是国内外公认的典型环保型草坪草，广泛用于园林、庭院、运动场和固土护坡的优良暖季型草坪[1]。目前，关于野牛草的形态特性[2]、坪用性状[3]、引种繁殖[4]、生态功能[5]、抗逆性[6-10]等方面研究较多，而对于野牛草种质资源遗传多样性评价、鉴定等分子水平方面研究报道较少。

ISSR（inter-simple sequence repeat）是在微卫星标记（simple sequence repeat，SSR）基础上发展起来的分子标记，具有揭示的多态性高、精确度高、检测方便的优点[11]。目前，广泛应用于植物品种鉴定、保护、遗传多样性、进化及其他分子水平的研究中，如在紫花苜蓿（Medicago sativa）、高羊茅（Festuca ovina）、冰草[Agropyron crstatum （L.） Gaertn.]、黑麦草（Secale cereale L.）等牧草及草坪草的研究中ISSR分子标记得到了广泛应用[12]。

尽管ISSR具有许多优点，但由于其本质还是基于PCR反应的一种分子标记，不同类型植物的PCR反应体系会具有一定的差异，所以为了ISSR分析结果的可靠性及可重复性，在进行遗传多样性分析等研究之前预先对PCR反应体系进行优化非常重要。本研究利用正交设计原理对影响野牛草ISSR反应的主要因素[包括引物（Primer）、Taq DNA 聚合酶、Mg2+、dNTP的用量]设计4因素3水平正交试验筛选最优反应体系；可为野牛草种质资源遗传多样性评价、种源鉴定及明确亲缘关系以及其他方面的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料来源

本试验材料为中坪1号野牛草种子剥去颖壳后经水培生长到约10 cm的幼嫩植株，采用改良CTAB法提取水培植株基因组DNA，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量及完整性，然后用紫外分光光度计法测定其浓度，根据检测浓度将其稀释为20 ng/μL后备用。

1.2野牛草ISSR-PCR反应体系的正交优化

本试验正交设计针对影响野牛草ISSR-PCR反应的4个主要因素引物、Taq DNA 聚合酶、Mg2+及dNTP的用量，利用正交设计助手3.1绿色版设计L9（34）正交试验进行4因素3水平筛选最优反应体系，具体正交设计见表1、表2。制备总体积为20 μL的PCR反应体系，除各变化因素外，每反应管中还含有Reaction Buffer（×10）2.0 μL以及稀释浓度为20 ng/μL的野牛草模板DNA 2.0 μL，不足20 μL部分用ddH2O补足，引物随机选用UBC808（序列为AGA、GAG、AGA、GAG、AGA、GC）。ISSR-PCR反应在Biometra Personal Thermal Cycler上进行；扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性1 min，然后55 ℃退火1 min，最后72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸6 min。反应完成后在扩增产物中加入4 μL上样缓冲液，使用1×TBE缓冲液，用含有 0.5 g/L 溴化乙锭（EB）的1.8%琼脂糖凝胶进行电泳（5 V/cm），电泳结束后用凝胶成像系统拍照。

1.3反應模板DNA用量筛选

根据上述试验结果确定ISSR-PCR的最佳反应体系，并应用上述体系中最佳的反应组合，同时为保证结果的重复性，随机引物仍选用UBC808以及20 μL的PCR反应体系，模板DNA（20 ng/μL）设置用量为1.0～4.5 μL（每梯度增加 0.5 μL）共8个处理来确定ISSR-PCR反应体系中野牛草模板DNA的最适用量。

1.4数据处理

利用正交设计助手3.1绿色版和Excel 2010进行数据处理。

2结果与分析

2.1ISSR-PCR反应体系的优化及建立

ISSR-PCR的反应结果与Mg2+、dNTP、引物及Taq DNA 聚合酶的用量4个因素密切联系。在本试验正交试验设计的9个扩增组合中，由于各组合成分用量的不同，扩增结果有比较明显的差异，但各组合都可扩增出较多的谱带（图1）。具体来说，1、2、3号处理组合除了明显的3条谱带较强外，其他谱带强度比较弱；4、7号组合谱带比较清晰，但多态性相对较差；6号组合条带扩增较多，但强度较弱；8、9号组合除多态性较低外，也没有得到最佳的效果。综合来看，5号组合条带多，背景干扰较小。经过综合对比，以谱带多态性高、背景影响低、主带清晰且副带明显为筛选原则，确定5号组合为野牛草ISSR-PCR的最适反应体系，即20 μL的体系中含引物（2.0 μmol/L）4.0 μL、Mg2+（25 mmol/L）1.6 μL、dNTP（2 mmol/L）2.0 μL以及Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL。

[FK（W9][TPZXB1.tif][FK）]

2.2模板DNA用量的确定

由图2可知，在20 μL的ISSR-PCR反应体系中，野牛草DNA模板的用量在1.0～4.5 μL（20 ng/μL）之间时，8个梯度的组合均能扩增出条带；但在模板用量较低（1.0～2.5 μL）时，造成扩增条带的较少。在模板用量为 3.0 μL 时，谱带多态性高；而当模板用量超过3.0 μL（3.5～4.5 μL）时，扩增出的谱带减少。通过全面比较，仍以谱带多态性高、背景影响低、主带清晰且副带明显为筛选原则，最后确定反应体系中DNA模板最适用量为3.0 μL。

2.3优化ISSR-PCR反应体系的建立

根据L9（34）正交试验以及采用梯度法对DNA模板用量的筛选结果，建立野牛草ISSR-PCR最优化反应体系，总计20 μL，其组分及各自用量见表3。

3讨论与结论

ISSR是基于PCR反应的一种分子标记，和其他分子标记技术类似，受到反应条件及所分析植物种类的影响，不同类型的植物对反应体系的要求存在较大的差异。为了得到可靠性高及具有可重复性的分析结果，对ISSR-PCR反应系统进行优化非常重要[13-14]。如果采用单因素设计对ISSR-PCR反应体系进行优化，则必须分别对每个影响因素进行多次的梯度试验，过程复杂繁琐且无法同时兼顾各影响因素间交互作用[15-18]；与单因素PCR设计比较，正交试验设计既具有均衡分散、综合可比及高效率等特性，又减少了试验的工作量，克服了单因素设计的缺点[19-22]，所以利用正交试验对ISSR-PCR的反应体系多因素组合进行筛选，可较快地找到最佳组合，从而迅速获得试验结果[23-28]。

为了建立ISSR-PCR最优化反应体系、提高反应的稳定性及特异性，本试验根据正交设计原理设计L9（34）正交试验，对影响ISSR扩增结果的关键因素（MgCL2、dNTP、引物、Taq DNA 聚合酶、DNA模板的用量）进行筛选，最后获得适合野牛草ISSR-PCR优化反应体系，即20 μL的反应体系中含有引物（2.0 μmol/L）4.0 μL、DNA模板（20 ng/μL）3.0 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、Reaction buffer（10×）2.0 μL、MgCl2（25 mmol/L）1.6 μL、dNTP（2 mmol/L）2.0 μL及ddH2O 7.2 μL。

ISSR分子标记具有步骤简单、迅速稳定和多态性高等优点，且试验进行前不须要获知植物的基因组背景，广泛应用于品种鉴定、分类、进化等方面的研究[13]。本研究中野牛草 ISSR-PCR 反应体系的建立，为ISSR-PCR技术进行野牛草种源鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系、优良性状标记以及其他分子水平的研究奠定了基础。

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