张文刚，雒雪丽，韩 雍，李忠宏

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

分子印迹Mn掺杂ZnS量子点磷光法检测烟酸转化液中的6-羟基烟酸

张文刚，雒雪丽，韩 雍，李忠宏*

(西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

以6-羟基烟酸(6-HNA)为模板，采用分子印迹溶胶-凝胶法合成了具有良好光学性质的印迹Mn掺杂ZnS量子点磷光传感器(MIP-QDs)。红外光谱(FT-IR)和扫描电镜(SEM)测试表明，印迹聚合物成功接枝在纳米传感器表面。吸附试验显示，MIP-QDs对6-HNA的亲和性与选择性显著高于其结构类似物阔马酸和烟酸，具备作为检测探针的潜力。在最优条件下，基于6-HNA可选择性猝灭MIP-QDs磷光而建立了灵敏、简便的检测微量6-HNA的光学新方法。当6-HNA浓度在3.4～67.0 μmol/L范围内，MIP-QDs的磷光猝灭率P0/P随浓度变化的关系符合Stern-Volmer方程(r2=0.996 5)，检出限为1.03 μmol/L。实际样品测定显示，6-HNA的回收率为91.0%～103.9%，相对标准偏差不超过4.5%，检测结果与HPLC法相一致(P>0.05)，方法具有良好的准确性和可行性。

量子点；分子印迹；磷光检测；6-羟基烟酸(6-HNA)；烟酸

6-羟基烟酸(6-HNA)是一种重要的化学中间体，在医药、农药、材料化学等领域应用广泛，例如用于合成吡啶甲胺类农药、5,6-二氯烟酸(减肥药)、发冷光材料等[1-2]。6-HNA主要通过两种途径生产：一是化学合成法；二是利用烟酸脱氢酶(NaDH)或具有NaDH活性的微生物转化烟酸底物来获得。其中化学合成法简单，但副产物较多且分离困难；而生物酶催化转化法在国内尚处于起步阶段，实际生产或研究中常需对大量废水、转化液、6-HNA产品进行即时分析检测[3-5]。目前，6-HNA的检测方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，该方法样品前处理复杂、耗时、成本高[6-7]。尹祖建等[8]报道了可同时测定底物中烟酸和6-HNA的双波长比色法，方法简单，准确度和精确度好，然而基于紫外吸收原理分析容易受到样品背景干扰，检测灵敏度偏低，因此研究快速、灵敏、简便的6-HNA检测方法对实际生产具有重要意义。

量子点(Quantum dots,QDs)的光学和电学性能优异，具有发展检测探针的极大潜力[9]。QDs除发射荧光外，少数稀土和过渡态金属离子掺杂的ZnS还可发射磷光。磷光相比荧光寿命更长，在检测中可避免样品基质自荧光和散射光的干扰，有效改善分析选择性和灵敏度[10]。磷光量子点中研究最多的是Mn掺杂ZnS(Mn-ZnS)QDs，由于其低毒、制备简单而被越来越多地用于生物分子、药物分子、环境和食品污染物等的磷光检测中[11-12]。QDs一般要经过表面功能化来提高检测特异性，而修饰后的QDs通过与目标分析物相互作用来改变其表面电荷和组成，甚至引起内核电子-空穴对重组并产生响应信号[13]。然而，常用的特异性配体如生物素、抗体、DNA适配子等难制备、易失活、成本高，限制了QDs的分析应用[14-15]。印迹聚合物(MIP)是一类在模板存在条件下由单体和交联剂共聚而成的聚合物，是一类选择识别性材料，可有效解决上述问题[16]。近年来，构建印迹QDs荧光或磷光传感器成为研究热点，已被广泛应用于药物、生物分子、无机污染物的检测[17-18]。本研究利用表面分子印迹溶胶-凝胶技术，以6-HNA为模板、3-氨基丙基三乙氧基硅烷为单体、硅酸四乙酯为交联剂制备了印迹聚合物修饰的磷光Mn掺杂ZnS 量子点传感器(MIP-QDs)，基于6-HNA选择性结合于印迹空穴后可猝灭MIP-QDs磷光的原理，构建了烟酸转化液中6-HNA的检测新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

傅立叶变换红外光谱仪(Vetex70 FTIR Spectroscope，Bruker Corp，德国布鲁克公司)，场发射扫描电子显微镜(FESEM，JEOL S-4800，日本日立公司)，紫外可见分光光度计(UV-Vis 2550，日本岛津公司)，荧光分光光度计(LS-55，Perkin-Elmer，美国铂金埃尔默公司)，液相色谱仪(LC-10AVPPLUS，日本岛津公司)。

七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、九水合硫化钠(Na2S·9H2O)、四水氯化锰(MnCl2·4H2O)、6-羟基烟酸(6-HNA)、阔马酸(CA)、烟酸(NC)购自Aladdin试剂公司。3-巯基丙基三乙氧基硅烷(MPTS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸四乙酯(TEOS)购自Adamas试剂公司。以上试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水；6-HNA,CA,NC标准溶液现用现配。

1.2 实验方法

1.2.1 MIP-QDs的制备 根据文献并进行适当的修改以制备MPTS修饰的Mn掺杂ZnS QDs(MPTS-QDs)和MIP-QDs[19]。MPTS-QDs以8 000 r/min离心后用水及无水乙醇洗3次，然后分散在乙醇中备用。根据猝灭因子QF(式1)，选择MPTS-QDs加量4 mL、模板与单体摩尔比1∶4及模板与交联剂比例1∶8为优化条件制备MIP-QDs。取20 mg 6-HNA加入10 mL热无水乙醇后超声溶解，加入单体APTES并搅拌预聚合30 min。再依次加入交联剂TEOS，MPTS-QDs和2.5 mL 5%的NH3·H2O后于室温搅拌反应20 h。非印迹量子点(NIP-QDs)的合成方法如上，但不加模板。以CH4O-TFA(体积比9.5∶0.5)作为混合溶剂在超声辅助下进行脱模板，直至洗脱液中检测不到模板分子。

1.2.2 MIP-QDs的吸附性能 根据预试验结果，选择0.1 mol/L pH 6.0 的PBS溶液为分析体系,配制浓度分别为0，5，10，15，20，30，50，100 μmol/L的6-HNA，CA，NC来评价MIP-QDs对模板分子的再结合性能及吸附选择性。于5 mL离心管中依次加入120 μL 1 mg/mL的MIP/NIP-QDs溶液、200 μL PBS及不同浓度的分析物溶液后定容至3 mL。将室温反应一定时间后的样品倒入四通光石英比色皿中进行磷光测定。光谱扫描范围为400～700 nm，扫描速率为800 nm/min，激发和发射狭缝分别为10 nm和20 nm，激发波长为320 nm。数据采用Stern-Volmer方程(式2)拟合得P0/P与分析物浓度之间的关系曲线及印迹因子(IF)，IF为MIP/NIP-QDs的Stern-Volmer常数KSV的比值。

(1)

P0/P=1+KSV[Q]

(2)

式中：P0与P分别为加入猝灭剂前后的磷光强度；ΔPMIP和ΔPNIP分别为MIP-QDs和NIP-QDs探针在加入猝灭剂前后的荧光强度差。

2 结果与讨论

2.1 MIP-QDs的表征

首先通过MPTS-QDs，MIP-QDs及NIP-QDs的红外光谱来判断Mn掺杂ZnS是否成功被印迹聚合物修饰(图1A)。由图1A可知，618 cm-1处的特征峰属于ZnS，而1 113，2 926，3 424 cm-1处的峰分别属于Si—O—Si宽的非对称强吸收峰、C—OH和C—H的伸缩振动，表明MPTS通过硅烷化沉积反应修饰在了ZnS QDs表面。MIP-QDs和 NIP-QDs红外光谱中在787，461 cm-1处的吸收峰为其表面硅壳中Si—O键的振动峰，波数为2 926，3 424，1 542 cm-1处的峰分别为脂肪族化合物—CH2—和N—H的伸缩振动，表明MIP/NIP-QDs表面存在—(CH2)3NH2。MIP-QDs和NIP-QDs的吸收峰相似，然而MIP-QDs在1 631 cm-1和1 065 cm-1的峰红移至1 685 cm-1和1 134 cm-1，表明MIP膜接枝成功且印迹过程未改变量子点的化学组成。印迹和非印迹量子点的表面形貌如图1B和D所示。MIP-QDs粒径约为20 nm，大于NIP-QDs的15 nm，且表面相对更为粗糙，表明在MIP-QDs表面产生了印迹效应且存在6-HNA的印迹膜层。MIP-QDs的光谱学表征结果如图1C所示，由图中可看出在最大激发波长320 nm左右激发时，荧光光谱在585 nm处具有一个强掺杂发射峰，在423 nm附近存在一个弱缺陷发射峰。与荧光光谱相比，MIP-QDs磷光光谱只存在585 nm处Mn2+掺杂引起的激发三线态(4T1)到基态(6A1)跃迁产生的长量子寿命、强对称发射峰[18]，同时印迹前后的峰形保持一致且尖锐，表明合成的该量子点传感器具有良好的发光性能。

2.2 MIP-QDs的吸附性能

吸附平衡和吸附动力学的结果如图2所示。由图2A可知，当在体系中加入50 μmol/L 的6-HNA后，MIP-QDs的磷光强度随着反应时间的延长而不断减小，且MIP-QDs结合6-HNA的速率在1.5 h前较快，之后逐渐减小直至4 h后趋近吸附饱和状态。而NIP-QDs相比MIP-QDs在整个吸附过程中P0/P变化很小，表明经印迹聚合物修饰后的MIP-QDs对6-HNA具有更高的亲和性与传质效率。由图2B可知，加入6-HNA后MIP-QDs的磷光猝灭率P0/P随着6-HNA浓度的增大而快速增大，且当浓度大于30 μmol/L后趋于常数，达到吸附平衡，此时MIP-QDs表面的印迹空穴及裸露的作用位点被6-HNA饱和，磷光猝灭基本稳定。由于印迹效应的存在，MIP-QDs的P0/P显著高于NIP-QDs，表明MIP-QDs对6-HNA具有更强的吸附能力。

2.3 MIP-QDs的选择性

考察了MIP-QDs对不同浓度6-HNA及其类似物CA及NC的选择性，结果如图3所示。由图3A可见，6-HNA及其结构类似物对MIP-QDs的磷光猝灭效应符合Stern-Volmer关系。随着分析物浓度增大，量子点的磷光强度呈线性减小，且磷光猝灭率的大小顺序为6-HNA>CA>NC，表明以6-HNA为模板经过印迹溶胶-凝胶反应后的MIP-QDs表面形成了在空间结构和化学作用位点上与6-HNA互补的印迹位点和空穴。6-HNA，CA和NC的pKa值分别为4.03，2.80和4.90，均低于吸附介质的pH 6.0，3种酸性结构类似物在pH 6.0时会发生去质子化电离出H+，而氨丙基在结合H+成为质子化的—(CH2)3NH3+后通过强静电作用力与负电性的6-HNA分子相结合造成磷光猝灭。由于pKa越小，酸分子越容易电离，因此6-HNA表现出了明显高于NC的猝灭效率[19]。CA的pKa值虽然最小，但由于CA分子结构与6-HNA存在较大差异，导致MIP-QDs对CA的印迹效应较弱。由图3B可知，3种分析物对NIP-QDs的磷光猝灭基本一致且CA和NC对印迹与非印迹探针的磷光(P0/P)相差不大，这是因为NIP-QDs表面不存在印迹膜层，其对分析物的结合仅限于表面的氨丙基、羟基等官能团。利用式(2)拟合后计算得6-HNA，CA，NC的IF分别为1.90，1.18和1.17，表明在酸碱、氢键及印迹效应作用下，MIP-QDs对6-HNA的结合选择性最高，从而使MIP-QDs可用于实际样品中6-HNA的分析检测。

小分子物质对QDs磷光猝灭的机制主要是电子转移或能量传递，然而6-HNA的特征紫外光谱和MIP-QDs的发射光谱(585 nm) 之间不存在光谱重叠，所以无能量转移。6-HNA的紫外吸收峰在加入APTES后存在红移(图1C中的曲线 d,e,f)且其吸收带(254 nm和295 nm)接近MIP-QDs的能量吸收带(图1C中的曲线c)，因此MIP-QDs的导带电子可以转移到6-HNA分子最低未被占用轨道(LUMO)，从而发生非辐射电子转移造成磷光猝灭[16,20]。6-HNA为烟酸的衍生物，相比烟酸具有对位的羟基，在存在邻位N取代且忽略位阻效应的条件下，羧基协同羟基具有更强的亲核能力，使具备电子供体及受体能力的6-HNA通过多重氢键作用与MIP-QDs的—NH2和醇羟基等位点相结合。当结合分析物的传感器受到一定波长的紫外光激发后，电子-空穴对发生分离，空穴被Mn2+俘获后形成新的复合中心并以磷光形式释放能量[21]。MIP-QDs导带的激发态电子由于不稳定而向基态跃迁，然而6-HNA的能量吸收带高于Mn掺杂ZnS QDs在430 nm附近的缺陷发射，导致电子直接从导带跃迁到6-HNA的最低未被占用轨道(LUMO)，从而产生磷光猝灭。

2.4 工作曲线建立

为构建6-HNA的快速光学检测方法，对孵育时间(20 min)及探针浓度(0.04 mg/mL)进行优化后得到工作曲线。不同浓度6-HNA对MIP-QDs和NIP-QDs磷光光谱的影响见图4。由图4可知，随着6-HNA浓度的增大，MIP-QDs和NIP-QDs的磷光强度不断降低，但其光谱无明显的蓝移或红移，表明6-HNA与MIP-QDs量子点表面产生了相互作用[22]，通过与印迹位点及表面基团之间的吸附结合猝灭磷光。图4插图显示了MIP-QDs和NIP-QDs的P0/P随着6-HNA浓度变化的关系，由于荧光或磷光猝灭符合Stern-Volmer方程，在线性关系良好的浓度范围内(3.4～67.0 μmol/L)将MIP-QDs磷光强度用式(2)拟合后得到方法线性方程为P0/P=0.003 8c+1.002 3(r2=0.996 5)，KSV,MIP=3 800 mol-1。NIP-QDs的拟合线性范围与印迹探针相同，但KSV,NIP=1 800 mol-1且r2=0.988 5，均小于MIP-QDs，表明经过印迹的量子点探针对6-HNA的识别性能更好。根据IUPAC标准计算得检出限(LOD,3σ/k)为1.03 μmol·L-1，其中k为标准曲线的斜率，σ为MIP-QDs的空白样品6次平行测定的标准偏差。本方法的LOD高于已报道的HPLC分析法[7]但低于紫外分析法[4,8]。此外，该磷光传感器以磷光Mn-ZnS QDs为信号平台并以高选择性、制备简便的表面分子印迹聚合物受体为识别配体，使得方法易操作、响应快、抗干扰能力强，相比色谱分析法不需要昂贵有毒的试剂及大型仪器设备，具有较好的应用前景。

2.5 实际样品分析

取酶法转化液样品，以水简单稀释至适当浓度后，按照建立的方法及HPLC法测定样品中的6-HNA浓度[8]，检测结果如表1所示，实际样品中6-HNA的本底值为3.7～4.0 μmol/L，在此基础上采用标准加入法研究方法的可行性。对3组不同加标水平的样品检测得到回收率为91.0%～103.9%，相对标准偏差(RSD)为3.2%～4.5%，且MIP-QDs和HPLC法的测定结果之间无显著差异(P>0.05)，表明该方法有较好的可行性。

3 结 论

本文以6-羟基烟酸(6-HNA)为模板通过分子印迹溶胶-凝胶技术制备了印迹聚合物修饰的Mn掺杂ZnS量子点光学传感器(MIP-QDs)，并用于6-HNA检测。MIP-QDs对6-HNA的吸附能力显著高于非印迹量子点。在酸碱、氢键、静电等作用力下，6-HNA与探针表面或印迹空穴中的—(CH2)3NH2之间通过电子转移猝灭磷光。MIP-QDs具有高亲和性与选择性，相比烟酸、阔马酸等结构类似物，其对6-HNA表现出选择识别性能。在优化条件下，MIP-QDs磷光猝灭符合Stern-Volmer方程，相应建立的光学检测方法可检测烟酸酶法转化液中微量的6-HNA。相比于HPLC法和紫外吸收检测法，该法传感器制备简单、成本低、灵敏度较高，具有一定的实际应用潜力。

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Detection of 6-Hydroxynicotinic Acid in Nicotinic Acid Conversion Fluid Using Molecularly Imprinted Polymer Capped Mn-doped ZnS Phosphorescent Quantum Dots

ZHANG Wen-gang,LUO Xue-li,HAN Yong,LI Zhong-hong*

(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

An optical nanosensor based Mn-doped ZnS quantum dots(QDs)was synthesized using 6-hydroxynictinic acid(6-HNA) as template via surface molecular imprinting sol-gel method.Fourier transform infrared spectroscopic(FT-IR) spectra and scanning electron microscopic(SEM) images showed that the imprinted polymer was successfully grafted onto MIP-QDs.Adsorption tests revealed that the affinity and selectivity of MIP-QDs for 6-HNA were significantly higher than its analogues nicotinic acid and coumalic acid.Under the optimized conditions,a phosphorescent sensor for detecting 6-HNA was constructed.The linear range for detection of 6-HNA was in the range of 3.4-67.0 μmol/L with a detection limit of 1.03 μmol/L and a correlation coefficient(r2) of 0.996 5.Recoveries of 91.0%-103.9% and relative standard deviations less than 4.5% were achieved in real samples,which were in good agreement with that of the high-performance liquid chromatographic(HPLC) method(P>0.05).The proposed method had good veracity and feasibility.

quantum dots;molecular imprinting;phosphorescence detection;6-hydroxynicotinic acid(6-HNA);nicotinic acid

QF=ΔPMIP/ΔPNIP

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.006

2016-11-03；

2016-11-27

国家自然科学基金项目(31371813)；国家科技部(863计划)项目资助(2013FY113400)

O657.3；TQ216

A

1004-4957(2017)04-0478-06

*通讯作者：李忠宏，博士，教授，研究方向：食品纳米技术，Tel:029-87038857，E-mail:steveli@nwsuaf.edu.cn