孙大庆+孙慧叶+魏玉龙

摘 要：蜡样芽孢杆菌是乳制品中容易污染的一种致病菌。为了鉴定市售牛奶中是否含有蜡样芽孢杆菌，该研究通过生化和分子生物学鉴定方法对牛奶中蜡样芽孢杆菌进行了分离和鉴定。结果表明，市售牛乳中分离、鉴定了一株蜡样芽胞杆菌，这表明蜡样芽胞杆菌对牛奶产品具有较大的食品安全风险。

关键词：牛奶；蜡样芽孢杆菌；安全风险

中图分类号 TS252.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）07-0039-02

Abstract：Bacillus cereus is a pathogen that is easily contaminated in dairy products.In order to identify whether the commercially available milk contains Bacillus cereus，this study isolated and identified Bacillus cereus in milk by biochemical and molecular biology identification methods. The results show that a strain of Bacillus cereus was isolated and identified in the separation of the commercially available milk，indicating that Bacillus cereus has a greater safety risk for milk products.

Key words：Milk；Bacillus cereus；Safety risk

蜡样芽孢杆菌是一种好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆菌，可产生致吐和致腹泻肠毒素，前者耐热，是引起食物中毒的主要成分[1]。芽孢是蜡样芽孢杆菌主要的繁殖方式，有些菌种能粘附在人的上皮细胞上，它们的致病机制有所不同[2]。目前我国还没有对由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒进行比较系统的调查、分析和统计，但是从我国的饮食结构、食品加工、保藏和运输条件等方面推测，蜡状芽孢杆菌的食品污染情况可能比较严重，尤其是营养丰富的乳制品[3-4]。因此，从食品安全的角度来看，很有必要对我国乳制品中蜡状芽孢杆菌的检出率、分布情况和毒素产生的情况进行调查，以查明污染途径、污染源，制订相应的检测标准和卫生安全标准，提供消毒和杀菌的指导，并为应对可能出现的突发食物中毒事件提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 10个不同品牌的纯牛奶，购自超市。

1.2 主要试剂及培养基 柠檬酸盐、甘露醇等发酵生化管，LB肉汤、营养琼脂和甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基均购自青岛海博生物有限公司；PCR Taq酶、琼脂糖购自上海生工生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 引物 检测菌株16S rDNA扩增采用细菌通用引

物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGCTACCTTGTTACG，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 蜡样芽胞杆菌分离和纯化 取样品牛奶25mL于无菌烧杯中，用接菌环取样划线分离于选择性培养基上，置于37℃培养12～20h，挑取可疑的菌株接种于营养琼脂培养基中，37℃培养18～24h。从单菌落分布均匀的平板中挑取单菌落再进行平板划线，进行菌种纯化。

1.5 鏡检 取营养琼脂上纯培养物少许，进行革兰氏染色实验，之后镜检观察结果。

1.6 分离菌株生化鉴定

1.6.1 淀粉水解试验 将分离株接种于3%可溶性淀粉试管中，在37℃培养24h。取出试管，在菌落处滴加碘液少许，观察。培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环。

1.6.2 明胶液化试验 用接种环挑取分离株于明胶鉴定管中，37℃培养48～72h，将其倒置，观察有无液体流动，有流动为阳性，无流动为阴性，夏天应置4℃，10min后观察结果。

1.6.3 V-P试验 将分离株接种于V-P鉴定管中，37℃培养24～48h，变为红色则为阳性，阴性不变色。

1.6.4 柠檬酸盐分解试验 将分离株划线接种于西蒙氏柠檬酸盐斜面培养基上，37℃，培养48～72h，每天观察结果，阳性者斜面上有菌落生长，培养基由绿色转为蓝色，反之为阴性。

1.6.5 卵黄反应 将分离株接种于卵黄试管中，置37℃培养18～24h，阳性反应卵黄颜色变浅，阴性无明显变化。

1.6.6 甘露醇发酵试验 将分离株接种至甘露醇发酵培养基中，置37℃培养18～24h，阳性反应能发酵产酸，培养基变为黄色，阴性不变色。

1.6.7 过氧化氢酶试验 将分离株接种于过氧化氢溶生化管中，观察结果，若30s内产生气泡者则为阳性，不产生气泡者为阴性。

1.6.8 动力试验 将分离株穿刺接种于动力培养基中，37℃培养24h，若扩散生长则为阳性反应。

1.6.9 葡萄糖发酵试验 将分离株接种于葡萄糖生化管中，37℃培养24h，培养基变为黄色为阳性反应。

1.6.10 溶血试验 取分离株接种于血琼脂平板上，37℃培养24h，阳性菌落周围呈现溶血环。

1.7 分离菌株16S rDNA鉴定 挑取检测菌单菌落于500μL的双蒸馏水中制成菌悬液，100℃水浴10min，立即冰浴20min，12 000r/min离心10min，取上清液作PCR扩增模板，-20℃保存备用[5]。PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸7min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司进行序列测定，利用Blast、DNA star软件对测序结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌体形态 在显微镜下菌体细胞为杆状，成短链状排列，菌体两端钝圆，生成的芽孢小于菌体横径，位于中心或稍偏于一端（图1）。

2.2 生化鉴定结果 根据生化鉴定结果（表1）可知，分离株生化实验结果与蜡样芽孢杆菌预期完全一致，因此该分离株初步鉴定为蜡样芽孢杆菌，命名为DQ14-ZC。

2.3 16S rDNA鉴定结果 经琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增获得一条约1.4kb大小的条带（图2），与预期大小相符。经BLAST比对分析，该基因序列与GenBank中多个蜡样芽孢杆菌16S rDNA基因具有99%以上的一致性，因此该分离株进一步鉴定为蜡样芽孢杆菌。

3 结论

本实验从10个不同品牌的纯牛奶中，通过蜡样芽胞杆菌选择培养基的分离、纯化，镜检，以及生理生化和16S rDNA鉴定，这表明可以从市售的纯牛奶产品中分离到蜡样芽胞杆菌，10个产品中蜡样芽胞杆菌污染率为10%。由此可见，虽然污染率较低，但仍存在较大的食品安全风险。

参考文献

[1]Griffiths M W.Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp.present in milk[J].Journal of Food Protection，1990，53（9）：790-792.

[2]Andersson A，Granum P E，R?nner U.The adhesion of Bacillus cereus spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism[J].International journal of food microbiology，1998，39（1）：93-99.

[3]殷全喜，張秀红，杜欣，等.一起蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒的调查报告[J].中国预防医学杂志，2006，7（2）：115-117.

[4]蒋建明.一起蜡样芽孢杆菌污染饮水引起食物中毒调查[J].浙江预防医学，2009，21（2）：38-39.

[5]王国利.芽孢杆菌溶血素BL的检测及B905hblA基因的克隆[D].北京：中国农业大学，2007.

（责编：张宏民）