王婷，岳英伟，杨淑萍，靳聪飞，辛向博，张晓娟，郭宏



酵母双杂交方法对牛CMYA1中Xin Repeat结构域的鉴定

王婷，岳英伟，杨淑萍，靳聪飞，辛向博，张晓娟，郭宏通信作者

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384）

CMYA1是肌肉生长发育相关基因，其表达产物包含若干个由16个氨基酸构成的重复序列，该重复序列被命名为Xin Repeat。为确定CMYA1的蛋白结合核心结构域，本研究利用酵母双杂交方法，以牛CMYA1基因的表达产物中含有Xin Repeat的区域作为预测结构域，通过对该区域的不同区段进行克隆建立酵母诱饵表达载体，并转化酵母菌，再与CMYA1的互作蛋白EIF3G和RPL35A进行酵母双杂交。结果表明，共获得了6个不同区段的CMYA1片段，并确定了4个Xin Repeat序列是蛋白结合结构域的最小功能单位。本研究结果有助于揭示CMYA1结构及Xin Repeat的功能，为进一步研究牛肌肉生长发育的分子机制提供理论依据。

CMYA1；Xin Repeat；结构域；酵母双杂交

CMYA1（Cardiomyopathy associated 1，原发性心肌症相关蛋白1）基因最早发现于鸡胚心肌细胞中，由此也被命名为Xin基因[1]。对CMYA1在转录水平和蛋白水平的组织表达特性研究发现，CMYA1基因从胚胎发育时期至成年期始终特异性表达于心肌及骨骼肌[2-5]。CMYA1蛋白序列中含有一个DNA结合结构域、一个核定位序列、一个脯氨酸富含区（SH3结构域）和若干个由16个氨基酸组成的被命名为Xin Repeat的保守序列单元[6]。Xin Repeat在蛋白结合及定位等方面发挥重要作用，是CMYA1中一段重要的结构域。Xin Repeat保守序列为GDV（K/Q/R/S）XX（R/K/T）WLFET（Q/R/K/T）PLD。通过对Xin Repeat序列在不同物种数据库中的检索发现，所有的脊椎动物（包括哺乳动物、禽类、两栖类、鱼类）中均出现Xin Repeat序列，而无脊椎动物中没有Xin Repeat序列[4]，且不同物种有不同数目的Xin Repeat，如鸡Xin基因（cXin）编码的蛋白有26个Xin Repeat，小鼠的同源基因CMYA1和CMYA3编码的蛋白分别有15个和28个Xin Repeat，牛CMYA1共有6个Xin Repeat。Xin Repeat是一些蛋白的结合结构域，免疫共沉淀和酵母双杂交结果显示，小鼠CMYA1蛋白的最后4个Xin Repeat是β-连环蛋白的结合结构域，直接与β-连环蛋白的533～746氨基酸位点结合[7-8]。通过对小鼠Xin Repeat区进行不同分段克隆并通过免疫共沉淀试验发现，3个Xin Repeat是肌动蛋白微丝的结合结构域[4]。研究结果表明，Xin Repeat具有结合蛋白的能力，且不同数目的Xin Repeat结合蛋白的能力不同。在之前的研究中，发现牛CMYA1可以通过其Xin Repeat区域与某些蛋白结合，并通过酵母双杂交互作确定了核糖体蛋白RPL35A和真核翻译起始因子3的一个亚基EIF3G分别是CMYA1的结合蛋白。本试验以牛CMYA1蛋白的Xin Repeat为预测结构域，通过对牛Xin Repeat区进行分段，并分别与已知的2个互作蛋白RPL35A和EIF3G进行酵母双杂交结合试验，确定Xin Repeat的核心结构域，本研究可为揭示CMYA1蛋白的结构及Xin Repeat的功能提供分子理论依据。

1 材料

1.1 质粒和菌株

质粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7-T、pGADT7-Lam、酵母菌株Y2H Gold均购于Clontech公司，质粒pGADT7-RPL35A和pGADT7-EIF3G由本实验室构建并均已转化菌株Y187。

1.2 主要试剂

Es-Mix、DNA胶回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒等购自康为世纪公司，T4连接酶、限制性内切酶RIHI购于Fermentas公司，卡那霉素、各种氨基酸、酵母基本氮源、MarkerⅠ、MarkerⅢ购于索莱宝公司。

2 方法

2.1 酵母表达载体构建

2.1.1 牛CMYA1分段及引物设计

通过NCBI对CMYA1及Xin Repeat区进行了序列分析，按照Xin Repeat的数量和分布及CMYA1阅读框规则进行分段，具体分段方法见图1。

图1 牛CMYA1基因Xin Repeat分布及分段示意图

（注：CMYA1蛋白全长为1 820 aa，XINRP1片段包含第一至第四Xin Repeat，XINRP2片段包含第三至第六Xin Repeat，XINRP3片段包含第一至第三Xin Repeat，XINRP4片段包含第四至第六Xin Repeat，XINRP5片段包含第一和第二Xin Repeat，XINRP6片段包含第五和第六Xin Repeat）

利用NCBI中的Primer-BLAST分别对6条CMYA1的Xin Repeat区片段进行设计引物，分别在上游引物5’端插入EcoRI酶切位点，在下游引物5’端插入BamHI酶切位点。引物序列见表1。

表1 Xin Repeat分段引物序列

2.1.2目的片段扩增

首先提取牛肌肉组织RNA，反转录为cDNA作为模板，分别向扩增体系中加入10 μL Es-Mix、0.5 μL上游引物（10 μmol/L）、0.5 μL下游引物（10 μmol/L）、1 μL cDNA（100 ng）和8 μL去离子水，使PCR扩增总体系达20 μL。

PCR反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，72 ℃终延伸10 min。最终对PCR产物以1%琼脂糖进行凝胶电泳检测，并对PCR产物进行回收，胶回收操作步骤按照康维世纪DNA胶回收试剂盒说明书进行。

2.1.3 酶切、连接及转化大肠杆菌

用限制性内切酶RI和HI对各条目的片段进行双酶切，同时对载体pGBKT7进行双酶切，反应体系和条件参照Fermentas限制性内切酶说明书。连接各片段和载体，连接液转化DH5α大肠杆菌感受态，在含有卡那霉素的LB平板上进行培养，对阳性克隆进行测序，并对测序结果进行序列比对，本试验所有测序由苏州金唯智公司提供。

2.2 重组质粒转化酵母菌

2.2.1 酵母菌感受态的制备

用醋酸锂方法对酵母菌株Y2H Gold进行感受态细胞的制备。将冻存的酵母菌株Y2H Gold在YPDA平板上划线培养3 d，挑取生长最快的单菌落于3 mLYPDA液体培养基中扩增培养8～12 h，取5 μL菌液于50 mL的YPDA中扩增培养16～20 h，使600达到0.15～0.30，600为0.30时，菌数约为108/mL。700 g离心5 min，弃上清，用100 mL新鲜YPDA重悬，继续摇菌培养3～5 h，使600达到0.40～0.50，不要过度培养。将菌液移至两个50 mL无菌离心管中，700 g离心5 min，弃上清，用30 mL无菌水重悬。500 g离心5 min，弃上清，用1.5 mL 1.1×TE/LiAc重悬，即为感受态细胞。

2.2.2 转化酵母菌

将构建好的诱饵载体分别转化到酵母菌株Y2H Gold感受态细胞中。向预冷的无菌管中加入混合体系：重组质粒100 ng、carrierDNA（需变性处理）1 μL、50 μL感受态细胞、500 μL PEG/ LiAc并温和混匀。30 ℃孵育30 min，每隔5 min摇一次离心管，再加入20 μL DMSO，42 ℃孵育15 min，每隔5 min摇一次离心管。高速离心15 s，弃上清，用YPD+重悬。50 r/min，30 ℃孵育30 min。高速离心15 s，弃上清，用1 mL 0.9%（/）NaCl溶液重悬。分别取100 μL涂布于SD/-Trp固体培养基，30 ℃培养箱中倒置培养3～4 d，直至单克隆长出。

2.3 自激活与毒性测试

将6组转化的酵母菌分别进行自激活与毒性测试，各取100 μL诱饵菌于培养基SD/-Trp和SD/-Trp/X中。同时建立对照组，将pGBKT7-53和pGADT7-T共转化于酵母菌中，并在QDO/X/A平板中生长且菌落成蓝即为阳性对照，将转化pGBKT7质粒并在SD/-Trp和SD/-Trp/X中培养的酶母菌作为正常对照。培养3～4 d后，如果试验组与正常对照组的生长情况一致，则未发生自激活和没有毒性，说明构建的诱饵载体可以进行下一步互作试验。

2.4 酵母双杂交互作

将6组重组诱饵菌株分别进行活化，具体操作方法是：首先在平板上挑取一个新鲜的大小约为2～3 mm的单克隆溶于50 mL SD/-Trp液体培养基中。250 r/min，30 ℃培养16～20 h，直到600达到0.8。换培养基，1 000 g离心5 min，弃上清。然后用4～5 mL培养基SD/-Trp重悬细胞，使细胞浓度大于108/mL。室温融化转化捕获菌pGADT7-EIF3G和pGADT7-RPL35A，将100 μL捕获菌和100～200 μL诱饵菌混合，加入10 mL 2×YPDA液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）于50 mL离心管中，30 r/min，30 ℃培养20～24 h。20 h后，用400倍显微镜镜检菌液，如观察到2～3个酵母细胞结合成“Mickey Face”形状，说明菌体融合成二倍体，如果没有融合至二倍体状态则继续培养2～4 h，直至二倍体形成。换培养基，1 000 g 10 min离心，弃上清，同时用2 mL 0.5×YPDA对烧瓶进行清洗，继续收集残留在烧瓶中的细胞。1 000 g 10 min离心，弃上清。用1 mL0.5×YPDA/kana液体培养基重悬细胞。取部分菌液进行互作效率验证：对菌体进行梯度稀释，分别取1/10，1/100，1/1 000，1/10 000稀释倍数下的100 μL菌液分别涂布缺陷型培养基SD/-Trp、SD/-Trp/X和QDO/X/A中，30 ℃培养3～5 d，直到单克隆长出。同时建立对照组，以转化pGBKT7-53的Y2H Gold菌株和转化pGADT7-T的菌株Y187的杂交互作结合作为阳性对照，阳性对照应该在QDO/X/A培养基中长出蓝色菌落。

3 结果

3.1 牛CMYA1分段扩增结果

PCR扩增获得Xin Repeat片段，共6个片段，条带大小分别为XINRP1，1 023 bp；XINRP2，696 bp；XINRP3，618 bp；XINRP4，291 bp；XINRP5，396 bp；XINRP6，177 bp（图2）。条带大小与预期一致。

图2 PCR扩增电泳图

（注：泳道1为XINRP1，长度为1 023 bp；泳道2为XINRP2，长度为696 bp；泳道3为XINRP3，长度为618 bp；泳道4为XINRP5，长度为396 bp；泳道5为XINRP4，长度为291 bp；泳道6为XINRP6，长度为177 bp）

3.2 牛Xin Repeat区的载体构建测序结果

将6条片段XINRP1至XINRP6分别构建到pGBKT7酵母表达载体中，转化感受态大肠杆菌，对阳性克隆进行测序，测序峰图见图3。利用NCBI对测序结果与CMYA1序列进行比对，序列全部正确。

图3 XINRP1-6测序结果

（注：A. XINRP1的部分测序结果的峰图及序列。B. XINRP2的部分测序结果的峰图及序列。C. XINRP3的部分测序结果的峰图及序列。D. XINRP4的部分测序结果的峰图及序列。E. XINRP5的部分测序结果的峰图及序列。F. XINRP6的部分测序结果的峰图及序列）

3.3 重组载体转化及验证结果

将构建好的重组载体pGADT7-XINRP1至XINRP6分别转化到酵母菌感受态中，同时建立阳性对照，即共转化质粒pGBKT7-53和pGADT7-T，并在SD/-Trp/X培养基中生长，另外以转化质粒pGBKT7的酵母菌在培养基SD/-Trp和SD/-Trp/X为正常对照，观察试验组和正常对照组的生长情况。研究结果见图4，由图4可以看出，转化试验组即转化pGADT7-XINRP1的诱饵菌在SD/-Trp和SD/-Trp/X培养基中生长的菌落数量大小与正常对照组无明显差别，说明转化质粒没有毒性，试验组在培养基QDO/A/X中不出现菌落生长，而阳性对照组长出蓝色菌落，说明重组质粒未发生自激活，说明诱饵菌可以用于酵母双杂交试验。

（注：A. 转化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp中生长。B. 转化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp/X中生长。C. 转化pGBKT7-XINRP1至Y2H Gold菌株并在培养基QDO/A/X中生长。D. 转化pGBKT7至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp中生长。E. 转化pGBKT7至Y2H Gold菌株并在培养基SD/-Trp/X中生长。F. 共转化pGBKT7-53和pGADT7-T至Y2H Gold菌株并在培养基QDO/A/X中生长）

3.4 酵母双杂交互作结果

分别以转化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7- XINRP6到酵母菌Y2H Gold中作为诱饵菌，分别与2个已知的CMYA1互作蛋白RPL35A和EIF3G进行一对一互作结合。通过缺陷型培养基SD/-Trp/-Leu筛选，结果表明，XINRP1和XINRP2对2个靶蛋白具有结合作用，如图5和图6所示。将第一次互作产生的阳性克隆分别转移至培养基QDO/X/A中，菌体呈蓝色，进一步说明XINRP1、XINRP2和RPL35A、EIF3G之间存在阳性结合（图7）。XINRP1和XINRP2分别含有4个Xin Repeat，结果说明4个Xin Repeat是结合RPL35A和EIF3G的核心结构域，3个及3个以下Xin Repeat不具有结合能力。

图5 转化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7-XINRP6的6个诱饵菌与pGADT7-RPL35A的互作结果

（注：A. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合，有菌落长出。B. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合，有菌落长出。C. 诱饵菌pGBKT7-XINRP3与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合，无菌落长出。D. pGBKT7-XINRP4与pGADT7-RPL35A杂交结合，无菌落长出。E. pGBKT7-XINRP5与pGADT7-RPL35A杂交结合，无菌落长出。F. pGBKT7-XINRP6与pGADT7-RPL35A杂交结合，无菌落长出）

图6 转化pGBKT7-XINRP1至pGBKT7-XINRP6的6个诱饵菌与pGADT7-EIF3G的互作结果

（A. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合，有菌落长出。B. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合，有菌落长出。C. 诱饵菌pGBKT7-XINRP3与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合，无菌落长出。D. 诱饵菌pGBKT7-XINRP4与pGADT7-EIF3G杂交结合，无菌落长出。E. pGBKT7-XINRP5与pGADT7-EIF3G杂交结合，无菌落长出。F. pGBKT7-XINRP6与pGADT7-EIF3G杂交结合，无菌落长出）

图7 对互作的阳性克隆在QDO/A/X培养基中的培养结果

（A. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合的阳性克隆。B. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-RPL35A杂交结合的阳性克隆。C. 诱饵菌pGBKT7-XINRP1与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合的阳性克隆。D. 诱饵菌pGBKT7-XINRP2与捕获菌pGADT7-EIF3G杂交结合的阳性克隆）

4 讨论

Xin Repeat是CMYA1蛋白中具有高度保守性的结构域，可以单独与一些蛋白发生互作，通过原位杂交等试验发现，富含Xin Repeat的基因高表达于肌卫星细胞及骨骼肌纤维中，Xin Repeat具有参与肌原纤维组装及维持肌纤维结构的作用，在对心肌发育及骨骼肌的分化形成方面起了重要作用[8-9]。在CMYA1与蛋白发生结合的过程中，Xin Repeat起到诸如亚细胞定位和提供蛋白结合位点等重要作用，Xin Repeat的个数在不同物种间的数量不同，其数量与功能有密切关系[6-8]，小鼠CMYA1的Xin Repeat可以直接结合肌动蛋白，并发现3个Xin Repeat是结合肌动蛋白的最小结合单位[4]。

牛CMYA1基因的功能和结构及Xin Repeat作为结构域的蛋白互作分子机制尚未研究清楚。前期研究中对牛CMYA1蛋白中的Xin Repeat进行序列比对分析，在牛CMYA1蛋白中共找到6个Xin Repeat的保守序列，本研究中按照数量不同对这段结构域进行分段，一共获得了6个不同的CMYA1片段，并成功构建了酵母双杂交系统的诱饵融合载体，通过对诱饵载体的自激活和毒性测试检测表明，所有CMYA1基因片段的表达对酵母不产生毒性且不发生自激活现象，可以用于酵母互作鉴定。本次试验选择2个已知与CMYA1的Xin Repeat区互作的蛋白EIF3G和RPL35A作为酵母互作试验的捕获蛋白。RPL35A基因的表达产物为核糖体蛋白，大多核糖体蛋白参与组成核糖体，但也有报道表明，一些核糖体蛋白有除构成核糖体以外的其他独立功能，如与蛋白结合的功能等[10]。EIF3G是真核转录起始因子，是调控肌肉发育和蛋白合成的关键因子[11-12]，EIF3基因是参与肌纤维蛋白合成的重要基因[13]。根据本试验中的结果表明，4个以上的Xin Repeat对RPL35A和EIF3G有结合能力，而4个以下Xin Repeat对RPL35A和EIF3G没有结合能力。由此说明，Xin Repeat是有独立功能的结构单元，且4个Xin Repeat是CMYA1与互作蛋白结合的最小结合单位。本研究结果对于揭示CMYA1中Xin Repeat的结构和功能提供了一定参考，可为CMYA1的研究和应用提供必要的理论依据。

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责任编辑：张爱婷

Identification of Xin Repeat Domain of CMYA1 in Bovine by Yeast Two-Hybrid

WANG Ting, YUE Ying-wei, YANG Shu-ping, JIN Cong-fei, XIN Xiang-bo, ZHANG Xiao-juan, GUO HongCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

CMYA1 is a muscle development related gene which expression product contains a number of repeat sequences composed of 16 amino acids, named Xin Repeat. To determine the CMYA1 domain of protein interaction, this study used Xin Repeats as a predicted domain of CMYA1. According to different number of Xin Repeats, we divided CMYA1 into different fragments and cloned into expression vectors and transformed into Yeast strain.As result, we obtained 6 fragments of CMYA1 fusion vectors for Yeast two-Hybrid as baits. The minimal unit of protein interacted domain was four Xin Repeats. This study revealed the structure of CMYA1 and the function of Xin Repeats, and provided a theoretical basis of molecular mechanism on bovine muscle growth and development.

CMYA1; Xin Repeat; domain; Yeast two-Hybrid

1008-5394（2017）01-0028-06

S813.1

A

2016-05-05

天津市自然科学基金项目“牛CMYA家族基因结构与功能研究”（11JCZDJC17600）

王婷（1985-），女，天津市人，硕士在读，研究方向为临床兽医学。E-mail：wangtingdbnd@126.com。

郭宏（1964-），男，内蒙古通辽人，教授，博士，研究方向为分子遗传与育种。E-mail：guohong64@163.com。