王贵升尹斐斐（①山东大学生命科学学院 山东 济南 250100 ②山东省动物疫病预防与控制中心 山东 济南 山东省威海市动物疫病预防控制中心）

肺炎克雷伯氏菌PCR检测方法的建立

王贵升①②尹斐斐③（①山东大学生命科学学院 山东 济南 250100 ②山东省动物疫病预防与控制中心 山东 济南 ③山东省威海市动物疫病预防控制中心）

依据GenBank中肺炎克雷伯氏菌的部分已知序列，利用Primer Premier 5设计两对引物，通过优化反应条件，建立一种检测肺炎克雷伯氏菌的诊断方法。特异性和敏感性试验显示，该方法能特异地检测肺炎克雷伯氏菌，其最低能检测的细菌浓度为1×10-4Mcf，整个检测扩增在3h内完成。该结果表明本试验所建立的PCR方法的灵敏度及特异性均较好，可用于快速检测肺炎克雷伯氏菌。

肺炎克雷伯氏菌 PCR 检测

肺炎克雷伯氏菌(K.pnenmoniae)是一种G-杆菌，属于肠杆菌科，条件性致病菌[1]。肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌在普通的营养琼脂、麦康凯琼脂等培养基上具有极高的相似性，细菌的形态、颜色、气味都很相近，革兰氏染色镜检中都是短小的G-小杆菌[2]。在常规的细菌培养中很难将肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌区别开来，而做细菌的生化鉴定和16sRNA鉴定需要比较长的时间，约3～4d的时间。如果做16sRNA鉴定还需要进行测序，成本比较高。另外，毛皮动物克雷伯氏菌病以支气管炎、肺炎，败血症，脑膜炎，腹膜炎，腹泻等为主要症状；与绿脓杆菌也引起的肺炎的症状相同[3-5]，因此，建立快速检测和鉴定肺炎克雷伯氏菌的方法具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 文中所涉及的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)，记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物(主要是水貂)中分离鉴定得到的；大肠杆菌(Escherichia coli)，记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物(主要是水貂)中分离鉴定得到的；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、记载于2012年1月至2014年7月从发病的毛皮动物(主要是水貂)中分离鉴定得到的；以上菌株除了肺炎克雷伯氏菌保存于中国微生物菌种保藏普通微生物中心(登记入册编号11222)，其余均保存在山东省动物疫病预防与控制中心。

1.1.2 主要试剂与仪器 普通营养琼脂，10×PCR反应液、Taq酶、MgCl2(25mmol/L)、dNTP(25mmol/L)均购自宝生物工程(大连)有限公司。细胞计数板；显微镜；生化培养箱；PCR仪为罗氏公司生产；Centrifuge 5417R台式冷冻离心机由德国Eppendorf公司生产。

1.1.3 引物设计 选取肺炎克雷伯氏菌的基因保守区，设计出相应引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，使用前用灭菌超纯水配成10μmol/L的浓度，-20℃保存备用。

表1 引物信息

1.2 方法

1.2.1 PCR体系建立 反应条件的优化，先建立优化单个菌的检测体系，在此基础上，逐步改变引物的浓度以达到最佳。

1.2.2 PCR特异性试验 选取经鉴定纯化的水貂源大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌，分别挑单个菌落于10ml无菌试管中过夜摇菌，得原菌液。按照优化好的PCR扩增条件，PCR扩增反应结束后，分别取5ul PCR扩增产物经1.5%(W/V)琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在BIO-RAD紫外凝胶成像系统上照相。

1.2.3 PCR敏感性试验 （1）将肺炎克雷伯氏菌7株划在普通营养琼脂上，取单个菌落作PCR反应的模版，其他反应体系和条件都不变，最后用灭菌双蒸水补充至50μl。（2）取培养了12h的肺炎克雷伯氏菌的单个菌落，于3ml 85%Nacl生理盐水中，将菌液浓度(麦式浓度)调整为0.1Mcf，并在此基础上进行50、100、1000倍稀释，即稀释后的菌液浓度为0.002、0.001、0.0001Mcf。各取其4µl做PCR反应的模版。其他PCR反应条件及反应体系都不变。

1.2.4 反应条件的优化 摸索反应条件，建立了50μl的反应体系：4μl待测样品、4μl引物对K1或/和引物对K2(上下引物各2μl)和25μl PCR试剂，用灭菌双蒸水补充至50μl。优化后的程序为：第一阶段预变性94℃3min；第二阶段94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃终延伸7min，得PCR扩增产物。

2 结果

2.1 PCR特异性试验结果

2.1.1 肺炎克雷伯氏菌的特异性 如图1所示，1～7泳道和9～15泳道为肺炎克雷伯氏菌的扩增产物，8和16泳道为阴性对照(蒸馏水)；1～8泳道第一对引物，9～16泳道第二对引物；7株肺炎克雷伯氏菌对扩增产物电泳及成像拍照，在303bp处均出现清晰条带。对扩增产物测序，其序列均如SEQ ID NO.5所示为肺炎克雷伯氏菌的特异性基因序列。可见，该引物能将肺炎克雷伯氏菌检测到。

图1 肺炎克雷伯氏菌的特异性试验M：DNA maker DL2000：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；下同

图2 大肠杆菌的特异性试验

2.1.2 对大肠杆菌的特异性试验 如图2所示，1～10泳道和12～21泳道为10株大肠杆菌的扩增产物；11和22泳道为阴性对照；1～11泳道是第一对引物；2～22泳道是第二对引物；10株大肠杆菌在303bp处没有出现条带。可见，该引物不能将大肠杆菌检测到。

2.1.3 对绿脓杆菌的特异性试验 如图3所示，1～10泳道和12～21泳道为10株绿脓杆菌的扩增产物；11和22泳道为阴性对照；1～11泳道是第一对引物；2～22泳道是第二对引物；在303bp处均没有出现条带。可见，该引物不能将绿脓杆菌检测到。

2.1.4 对肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和绿脓杆菌混合菌的特异性试验 如图4所示，1～3泳道为第一对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌三种混合菌液的结果；4～6泳道为第一对引物检测肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌两种混合菌液的结果；7～9泳道为第一对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌两种混合菌液的结果；10泳道为阳性对照，检测肺炎克雷伯氏菌的结果；11泳道为阴性对照；12～14泳道为第二对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌三种混合菌液的结果；15～17泳道为第二对引物检测肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌两种混合菌液的结果；18～20泳道为第二对引物检测肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌两种混合菌液的结果；21泳道为阳性对照，检测肺炎克雷伯氏菌的结果；22泳道为阴性对照；可见，此两对引物对肺炎克雷伯氏菌具有良好的特异性，能够将肺炎克雷伯氏菌与混淆程度很大的大肠杆菌和绿脓杆菌区分开。

图3 绿脓杆菌的特异性试验

图4 肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和绿脓杆菌混合菌的特异性试验

2.2 PCR敏感性试验结果

2.2.1 肺炎克雷伯氏菌单个菌落敏感性 如图5，肺炎克雷伯氏菌7株单个菌落就可以用该引物检测到，说明此引物敏感性良好。

图5 肺炎克雷伯氏菌单个菌落敏感性试验

2.2.2 肺炎克雷伯氏菌梯度稀释后敏感性 如图6、7，引物对K1对肺炎克雷伯菌的敏感性试验结果；1、2泳道菌液模版浓度为0.002Mcf，3、4泳道菌液模版浓度为0.001Mcf，5、6泳道菌液模版浓度为0.0001Mcf，7泳道菌液模版浓度为0.1Mcf作为阳性对照，8泳道为阴性对照；引物对K2对肺炎克雷伯菌的敏感性试验结果； 1、2泳道菌液模版浓度为0.002Mcf，3、4泳道菌液模版浓度为0.001Mcf，5、6泳道菌液模版浓度为0.0001Mcf，7泳道菌液模版浓度为0.1Mcf作为阳性对照，8泳道为阴性对照；可见，当菌液浓度为0.0001Mcf时仍可见清晰的条带，说明该引物的敏感性较高。

图6 引物对K1的敏感性试

图7 引物对K2的敏感性试验

3 结论

随着毛皮动物养殖业向规模化、集约化发展，毛皮动物疾病越来越复杂，病毒、细菌等多病原混合感染的现象日益突出[6]。当毛皮动物养殖场发生疫病时，应将实验室检查与现场诊断相结合，传统技术与现代化技术相结合，综合分析，找出主要病原和诱发因素[7]。本方法的建立，能够快速的将肺炎克雷伯氏菌与大肠杆菌、绿脓杆菌区分开。为临床治疗方案制定争取了时间。

[1] 陈溥言. 兽医传染病学(第5版)[M]. 北京∶ 中国农业出版社, 2006∶116.

[2] 张诗渝. 肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究[D].南京农业大学, 2013.

[3] 曹荣峰, 田洪宇, 王继芳等. 水貂细菌性疾病的病原学调查[J]. 经济动物学报, 2008(12)∶ 21-23.

[4] 钟世勋, 迟珊珊, 王振等. 山东规模化养殖场毛皮动物多重感染病原学分析[J]. 中国兽医学报, 2014, 34(11)∶ 1770-1777.

[5] 陈思, 吕文雪, 许皓等. 引起毛皮动物肺炎的主要病原微生物及特征[J]. 中国毛皮动物科学研究进展, 2014(2)∶ 164-169.

[6] 任桥, 徐玉, 刘焕奇等. 水貂出血性败血症继发克雷伯菌病的诊断与治疗[J]. 中国兽医杂志, 2012(9)∶ 77-79.

[7] 钱爱东, 李影. 兽医全攻略毛皮动物疾病[M]. 北京∶ 中国农业出版社, 2009∶ 238-239.

S852.61+2

A

1007-1733(2017)04-0006-02

2017–01–11）

山东省毛皮动物产业技术体系创新团队项目（SDAIT-18-011-05)