贾小娥 朱 伟 樊 燕 谢 伟 姜树原 石 蕊 刘晓蕾 许文强 张颜波 邵 国，3*

(1.包头医学院，内蒙古 包头 014060； 2.泰山医学院附属医院神经内科，山东 泰安 271000；3.首都医科大学宣武医院，北京 100053)

斑马鱼组蛋白甲基转移酶在巨噬细胞炎症迁移中的作用研究*

贾小娥1#朱 伟1#樊 燕1谢 伟1姜树原1石 蕊1刘晓蕾1许文强1张颜波2，3*邵 国1，3*

(1.包头医学院，内蒙古 包头 014060； 2.泰山医学院附属医院神经内科，山东 泰安 271000；3.首都医科大学宣武医院，北京 100053)

目的 研究组蛋白甲基转移酶是否参与了巨噬细胞炎症迁移的过程。方法 利用斑马鱼尾巴创伤后巨噬细胞向炎症部位迁移的模型，采用全胚胎原位杂交的方法检测巨噬细胞迁移前后58个斑马鱼组蛋白甲基转移酶的表达变化情况。结果 斑马鱼尾巴创伤后，巨噬细胞开始向炎症部位迁移，并在尾巴切除后6 h聚集在尾部的巨噬细胞达到最多。原位杂交结果显示在尾巴创伤后巨噬细胞迁移6 h后，有3个斑马鱼组蛋白甲基转移酶的表达水平有变化。结论 斑马鱼组蛋白甲基转移酶可能参与了巨噬细胞炎症迁移的过程。

组蛋白甲基转移酶；斑马鱼；巨噬细胞；炎症迁移

组蛋白甲基化修饰是表观遗传修饰中重要的研究方向，参与了染色质的形成、基因组印记、基因转录调控等多种重要生理活动。组蛋白甲基化修饰主要由组蛋白甲基转移酶(Histone methyltransferase, HMTs)负责，一般发生在组蛋白赖氨酸和精氨酸残基上。众多文献和数据表明，组蛋白甲基化修饰和组蛋白甲基转移酶的异常表达与多种肿瘤的发生、发展有密切关系，如PRMT6在结肠癌中扮演着原癌基因的作用[1]；SETD2和EZH2与慢性淋巴细胞白血病的发病有密切联系并在慢性淋巴细胞白血病患者中有高表达[2-3]；G9a在多种癌症中有高表达并与低预后相关[4]。而靶向组蛋白甲基转移酶、改变异常的组蛋白甲基化状态成为肿瘤治疗的新靶点和策略[5-6]。巨噬细胞是多功能的免疫细胞，其中巨噬细胞向炎症部位的迁移是机体执行免疫功能的重要环节，该迁移机制的失调是许多炎性疾病、自身免疫性疾病以及肿瘤转移等疾病的共同原因之一。已有研究揭示了巨噬细胞和炎症的调控机制，通过影响炎性因子的生成和释放激活炎症复合体和巨噬细胞。而组蛋白甲基转移酶是否参与了巨噬细胞炎症迁移的过程，目前尚无研究报道。为此本研究使用斑马鱼作为模式生物，通过斑马鱼尾部创伤造成炎症伤口，建立巨噬细胞向炎症部位迁移的模型，研究斑马鱼组蛋白甲基转移酶在巨噬细胞迁移前后是否有表达变化，探究组蛋白甲基转移酶是否参与了巨噬细胞迁移调控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Tubigen系野生型斑马鱼和转基因斑马鱼Tg(zlyz:EGFP)由包头医学院斑马鱼模式动物平台保种并饲养，14 h光照/10 h黑暗交替循环，恒温28. 5±0. 5 ℃，pH7.2 ～7.5。

1.1.2 质粒 斑马鱼58个组蛋白甲基转移酶的探针质粒由Dr. Xu Pengfei惠赠。

1.1.3 主要试剂 Takara 限制性内切酶：EcoRI, SalI。试剂盒:质粒小提试剂盒，普通DNA产物纯化试剂盒，T3 mMESSAGE mMACHINE Kit，T7 mMESSAGE mMACHINE Kit, NucAway Spin Columns(Ambion)纯化试剂盒，RNA地高辛标记试剂盒(DIG RNA Labeling Kit，Roche)，显色试剂盒BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector laboratories)。

1.2 方法

1.2.1 对斑马鱼胚胎尾巴进行切割造成损伤 斑马鱼胚胎和Tg(zlyz:EGFP)转基因斑马鱼胚胎受精后60 h(60 hour post fertilization, 60 hpf)置于含0.1 mg/ml tricaine麻醉剂的培养液中，采用无菌手术刀片切割掉斑马鱼胚胎的尾巴，造成人为的急性创伤(不损及循环)，收集切割0 h(0 hours-post-tail-transection, 6hptt)和6 h后(6 hours-post-tail-transection, 6hptt)的胚胎甲醛固定或荧光显微镜下观测巨噬细胞的迁移。

1.2.2 地高辛标记的反义mRNA探针的制备 合成探针时，以限制性内切酶线性化的组蛋白甲基化转移酶的质粒为模板，用SP6 RNA聚合酶体外转录得到反义探针。探针体外转录采用RNA地高辛标记试剂盒(DIG/ Fluorescein RNA Labeling Kit，Roche)，步骤参照试剂盒说明书。合成的探针用 NucAway Spin Columns(Ambion)进行纯化，经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，-80 ℃保存。

1.2.3 斑马鱼整体胚胎原位杂交 收集切割0 hptt和6 hptt的胚胎，4%甲醛4 ℃固定过夜，甲醇梯度脱水，置于-20 ℃100%甲醇溶液备用。甲醇梯度复水，蛋白酶K消化胚胎，用PBST洗去消化液后。68 ℃杂交炉中预杂交1 h，然后加入相应的组蛋白甲基转移酶的反义RNA探针杂交过夜。杂交后第2 d回收探针并加入SSCT梯度清洗胚胎，加入anti-Dig-AP抗体与反义探针4 ℃结合过夜。杂交后第3 d用PBST洗去多余抗体，加入显色试剂 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector laboratories)溶液，避光室温轻摇染色，观测显色情况。染色结束后，PBST洗净染液，在体视显微镜下(Nikon SMZ18)观察记录结果后并拍照。

1.2.4 荧光显微镜拍摄巨噬细胞的迁移 将切尾巴0 hptt和6 hptt的斑马鱼胚胎放置于含0.1 mg/ml tricaine麻醉剂的胚胎培养液中，使用Nikon SMZ18荧光显微镜对胚胎巨噬细胞的迁移进行观察和拍照。

2 实验结果

2.1 切尾巴引起组织炎症时巨噬细胞的迁移行为

当用刀片造成尾巴创伤后，引起组织炎症反应，而巨噬细胞作为先天免疫细胞迅速地向伤口迁移。使用金属蛋白酶mmp13特异性的标记单核巨噬细胞，如图Fig 1A-D所示，在切尾巴0 hptt时，巨噬细胞主要集中在循环中，尾巴切口处很少有单核巨噬细胞；而在切尾巴6 hptt后，可见尾巴切口处聚集大量单核巨噬细胞。为了进一步说明巨噬细胞在炎症发生时向伤口迁移，我们使用了转基因斑马鱼Tg(zlyz:EGFP)，该转基因系中巨噬细胞特异表达基因lyz的启动子驱动绿色荧光蛋白的表达，因此绿色荧光蛋白能够实时特异的标记巨噬细胞。如图1所示，在切尾巴0 hptt时，绿色的巨噬细胞主要集中在循环中，尾巴切口处很少有单核巨噬细胞；而在切尾巴6 hptt后，可见尾巴切口处聚集大量绿色单核巨噬细胞。由上述实验说明，巨噬细胞在尾巴创伤后后6 hptt向炎症伤口处迁移。

图1 尾巴创伤后炎症时巨噬细胞的迁移行为

A. 尾巴创伤后0 hptt时金属蛋白酶mmp13的原位杂交结果；B. 尾巴创伤后6 hptt时金属蛋白酶mmp13的原位杂交结果；C. A图的局部放大图；D. B图的局部放大图；E. 尾巴创伤后0 hptt时转基因系Tg(zlyz:EGFP)巨噬细胞的荧光图片；F. 尾巴创伤后6 hptt时转基因系Tg(zlyz:EGFP)巨噬细胞的荧光图片

2.2 斑马鱼组蛋白甲基转移酶在巨噬细胞迁移中的作用

我们使用原位杂交技术分别检测了58个组蛋白甲基转移酶在尾巴创伤后巨噬细胞迁移前(0 hptt)和巨噬细胞迁移后(6 hptt)的表达变化情况。如图2～7所示，大部分组蛋白甲基转移酶在巨噬细胞迁移前后(0 hptt和6 hptt)的表达水平没有明显变化。其中ehmt1a在中后脑边界处有微弱的表达水平减弱；prdm8a在后脑处有表达上升；而prdm13在后脑处表达水平有减弱。

图2 尾巴创伤后巨噬细胞0 hptt和6 hptt组蛋白甲基转移酶家族I的表达变化

图3 尾巴创伤后巨噬细胞0 hptt和6 hptt组蛋白甲基转移酶家族II、III、IV的表达变化

图4 尾巴创伤后巨噬细胞迁移前和迁移后组蛋白甲基转移酶家族V的表达变化

图5 尾巴创伤后巨噬细胞0 hptt和6 hptt组蛋白甲基转移酶家族VI、VII、VIII的表达变化

图6 尾巴创伤后巨噬细胞0 hptt和6 hptt组蛋白甲基转移酶家族IX的表达变化

图7 尾巴创伤后巨噬细胞0 hptt和6 hptt组蛋白甲基转移酶家族X的表达变化

SubfamilyGenenameDescriptionGenBankAccessionNumberClosestHumanHomologIehmt2euchromatichistonelysineN-methyltransferase2DQ840136EHMT2Iehmt1beuchromatichistonemethyltransferase1bDQ355788,DQ840137EHMT1Iehmt1aeuchromatichistonemethyltransferase1aDQ840138EHMT1Isuv39h1bsuppressorofvariegation3-9homolog1b(Drosophila)DQ840139SUV39H1Isuv39h1asuppressorofvariegation3-9homolog1a(Drosophila)DQ840140SUV39H1Isetdb2SETdomain,bifurcated2DQ358104SETDB2Isetdb1bSETdomain,bifurcated1bDQ358103,DQ840141SETDB1Isetdb1aSETdomain,bifurcated1aDQ840142SETDB1IIsetmarSETdomainandmarinertransposasefusiongeneDQ840143SETMARIIIash1lash1(absent,small,orhomeotic)-like(Drosophila)DQ840144ASH1LIIIsetd2SETdomaincontaining2DQ343298,DQ840145SETD2IIInsd1bnuclearreceptorbindingSETdomainprotein1bDQ840146NSD1IIInsd1anuclearreceptorbindingSETdomainprotein1aDQ840147NSD1IIIwhsc1Wolf-Hirschhornsyndromecandidate1DQ358102,DQ840148WHSC1IIIwhsc1l1Wolf-Hirschhornsyndromecandidate1-like1DQ840149WHSC1L1IVezh2enhancerofzestehomolog2(Drosophila)DQ840150EZH2IVezh1enhancerofzestehomolog1(Drosophila)DQ840151EZH1Vmll2myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia2DQ840152MLL2Vmll3amyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia3aDQ840153MLL3Vmll3bmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia3bDQ840154MLL3Vmll4bmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia4bDQ840155MLL4Vmll4amyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia4aDQ840156MLL4Vmllmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia(trithoraxhomolog,Drosophila)DQ355790,DQ355791,DQ840157MLLVsetd1aSETdomaincontaining1ADQ355789,DQ851808SETD1AVsetd1baSETdomaincontaining1BaDQ851809SETD1BVsetd1bbSETdomaincontaining1BbDQ851810SETD1BVIsetd8bSETdomaincontaining8bDQ851825SETD8VIsetd8aSETdomaincontaining8aDQ343297,DQ851826SETD8VIIsetd7SETdomaincontaining7DQ851811SETD7VIIIsetd5SETdomaincontaining5DQ851812SETD5VIIImll5myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia5(trithoraxhomolog,Drosophila)DQ851813MLL5IXsuv420h1suppressorofvariegation4-20homolog1(Drosophila)DQ851814SUV420H1IXsuv420h2suppressorofvariegation4-20homolog2(Drosophila)DQ851815SUV420H2IXsetd6SETdomaincontaining6DQ851816SETD6IXsmyd5SETandMYNDdomaincontaining5DQ851817SMYD5IXsmyd4SETandMYNDdomaincontaining4DQ851818SMYD4IXsmyd1bSETandMYNDdomaincontaining1bDQ851819SMYD1IXsmyd1aSETandMYNDdomaincontaining1aDQ851820SMYD1IXsmyd3SETandMYNDdomaincontaining3DQ851821SMYD3IXsmyd2bSETandMYNDdomaincontaining2bDQ851822SMYD2IXsmyd2aSETandMYNDdomaincontaining2aDQ851823SMYD2Xprdm16PRdomaincontaining16DQ851827PRDM16Xprdm3PRdomaincontaining3DQ851828PRDM3Xprdm5PRdomaincontaining5DQ851829,EU258933PRDM5Xprdm2PRdomaincontaining2DQ851830PRDM2Xprdm8bPRdomaincontaining8bDQ851833PRDM8Xprdm8aPRdomaincontaining8aDQ851834PRDM8Xprdm13PRdomaincontaining13DQ851835PRDM13Xprdm9PRdomaincontaining9DQ851831PRDM7,PRDM9Xprdm11PRdomaincontaining11DQ851832PRDM11Xprdm12PRdomaincontaining12DQ851836PRDM12Xprdm6PRdomaincontaining6DQ851837,EU258934PRDM6Xprdm14PRdomaincontaining14DQ851838PRDM14Xprdm1aPRdomaincontaining1aDQ851839PRDM1Xprdm1bPRdomaincontaining1bDQ851840PRDM1Xprdm1cPRdomaincontaining1cDQ851841,EU258932PRDM1Xprdm15PRdomaincontaining15DQ851842PRDM15Xprdm4PRdomaincontaining4DQ851843PRDM4

2.3 斑马鱼组蛋白甲基转移酶

斑马鱼共有58个组蛋白甲基转移酶(见表1)。斑马鱼组蛋白甲基转移酶可分为10个亚家族，由于在脊椎动物中存在基因组的复制拷贝过程，在斑马鱼中有些组蛋白甲基转移酶有两个拷贝，如人类组蛋白甲基转移酶EHMT1在斑马鱼中有两个相应的同源基因ehmt1a和ehmt1b;人类组蛋白甲基转移酶SUV39H1在斑马鱼中有两个相应的同源基因suv39h1a和suv39h1b。

3 讨 论

斑马鱼尾巴创伤后形成炎症反应，巨噬细胞作为先天性免疫重要的免疫细胞，向炎症部位大量迁移。如图1所示，使用金属蛋白酶mmp13标记巨噬细胞，在尾巴创伤后6 hptt时明显可见巨噬细胞向炎症伤口处迁移聚集；转基因系Tg(zlyz:EGFP)标记巨噬细胞，在尾巴创伤后6 hptt时明显可见绿色的巨噬细胞向炎症伤口处迁移聚集，说明本研究中斑马鱼尾巴创伤后巨噬细胞迁移模型是可行的、可操作的。随后我们利用斑马鱼尾巴创伤引起巨噬细胞迁移的模型，检测了58个斑马鱼组蛋白甲基转移酶基因在巨噬细胞迁移前后的表达变化。结果显示有3个组蛋白甲基转移酶基因(ehmt1a、prdm8a、prdm13)在巨噬细胞迁移前后有变化(见图2～7所示)。这一结果也印证了近年来组蛋白甲基化修饰可能和炎症免疫反应有关[7-10]，如组蛋白甲基转移酶SMYD2通过抑制免疫因子的生成和释放负向调节巨噬细胞的功能和活化[9]；EZH2通过组蛋白甲基转移酶调节NK细胞的分化和功能[10]。然而我们仅找到3个表达水平有变化的组蛋白甲基转移酶。目前研究显示调节巨噬细胞迁移的机制多是快速的免疫因子释放和JNK、AKT和ERK等磷酸化变化[11-12]。因此仅有3个表达水平变化的组蛋白甲基转移酶，这一结果可能是由于巨噬细胞的迁移过程迅速，而组蛋白甲基转移酶所调控的表观遗传学变化相对速度较慢、需要更长的时间，因而在我们的研究中没有明显的变化。而有微弱变化的三个组蛋白甲基转移酶ehmt1a、prdm8a、prdm13，其如何变化以及调控网络还需要后续实验的进一步验证和探讨。

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The study of zebrafish histone methyltransferase functions in macrophages inflammatory migration

JIA Xiao-e1#ZHU Wei1#FAN-Yan1XIE Wei1JIANG Shu-yuan1SHI Rui1LIU Xiao-lei1XU Wen-qiang1ZHANG Yan-bo2，3*SHAO Guo1，3*

(1. Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia Autonomous Region, 014060, China; 2. Department of Neurology，Affiliated Hospital of Taishan Medical College. Taian 271000,China; 3. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing, 100053，China)

Objective:The aim of this study was to explore whether histone methyltransferases (HMTs) involve in the inflammatory process of macrophages migration.Methods: We detected the expression levels of the zebrafish 58 histone methyltransferases before or post macrophages migration by whole-mount in situ hybridization (WISH), using the model of macrophages migration in response to the tail wound.Results: We show that macrophages migrate rapidly to the site of acute injury induced by tail transection, and at 6 hours-post-tail-transection (6 hptt) the number of macrophages that aggregate in the wound reaches a maximum.The expression level of three histone methyltransferases had changed slightly at 6 hours-post-tail-transection.Conclusion: Some histone methyltransferases may play an essential role in macrophages migration in response to inflammation injury in zebrafish.

histone methyltransferases (HMTs); zebrafish; macrophages; migration

国家自然科学基金项目(81060212,81160244,81360316,81460283,81550038，81660307，81660204)；内蒙古自然科学基金(2014MS0810，2015BS0801，2015BS0807，2016MS (LH)0307)；包头医学院博士科研启动基金(BSJJ201632，BSJJ201623，BSJJ201617)；内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目(NJZY16207)；泰山医学院高层次培育课题(2016GCC02)

贾小娥(1984—)，女，内蒙古包头市人，讲师，博士，主要研究方向发育生物学。

朱伟(1984—)，男，山东莱芜人，硕士，包头医学院药学院，主要研究方向神经生物学。

R392

A

1004-7115(2017)02-126-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.002

2016-11-12)

# 并列第一作者；*通讯作者