吴燕，李英波，梁向峰，刘会洲，肖建辉

1(遵义医学院附属医院，医药生物技术研究所，贵州 遵义，563003)2(中国科学院过程工程研究所，中国科学院绿色过程与工程院重点实验室，北京，100190)3(中国科学院青岛生物能源与过程研究所，中国科学院生物基材料重点实验室，山东 青岛，266101)

纳豆激酶液态发酵生产的研究进展

吴燕1,2，李英波2*，梁向峰3，刘会洲2，肖建辉1*

1(遵义医学院附属医院，医药生物技术研究所，贵州 遵义，563003)2(中国科学院过程工程研究所，中国科学院绿色过程与工程院重点实验室，北京，100190)3(中国科学院青岛生物能源与过程研究所，中国科学院生物基材料重点实验室，山东 青岛，266101)

纳豆激酶(EC 3.4.21.62)是一种具有强大溶栓活性的丝氨酸蛋白酶。与临床一线溶栓药物(尿激酶和链激酶)相比，纳豆激酶具有安全性好、成本低、半衰期长和可口服等优点，作为溶栓药物或保健食品备受关注。纳豆激酶主要通过固态和液态发酵生产来制备，但现有生产能力偏低，远不能满足市场需求。文中从高产纳豆激酶的菌株选育、培养基优化、发酵条件优化和培养方式等4个方面对近年来相关研究进行了综述，以期为纳豆激酶的生产和应用提供支持。

纳豆激酶；微生物；液态发酵；溶栓药物

血栓性疾病严重危害人类健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。据统计，目前全世界每年约有1 700万患者死于血栓性疾病，且仍呈高发态势，预计到2020年，该病导致的死亡人数将达到每年2 500万[1]。我国每年进行溶栓治疗的患者超过300万[2]。因此，高效溶栓药物的研制备受关注。目前临床上常用的溶栓药物如尿激酶、蚓激酶和纤溶酶原激活剂等存在副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点。相比之下，微生物源纤溶酶，具有可口服、安全、高效、持久和廉价等优势，而日益引起人们的重视。在众多已报道的微生物纤溶酶中，纳豆激酶(EC 3.4.21.62)以其强大的溶栓效果备受青睐。纳豆激酶是1987年日本学者SUMI[3]从日本传统发酵食品纳豆中发现的一种具有显著纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，由纳豆枯草杆菌(Bacillussubtilisnatto)产生。随后，研究人员在中国豆豉、韩国发酵豆制品等发酵食品中也发现了该酶。1992年日本学者NAKAMURA[4]首次对纳豆激酶基因aprN进行了克隆并对包含调控序列的1 473 bp的基因序列全长进行了测定。该酶的分子量为27.7 kDa，是由275个氨基酸残基组成的单链多肽酶，在pH 7～12的范围内具有强大的纤维蛋白溶解活性[3,5]。药理研究表明，纳豆激酶不但可以直接水解交联纤维蛋白，而且可以激活体内的尿激酶原转变成为尿激酶，刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，间接地通过降解和失活尿激酶和t-PA的抑制剂pAI-1，发挥溶解纤维蛋白的作用[6-8]。此外，纳豆激酶具有抗胰酶水解的能力，在胃肠道中具有良好的稳定性，且可被肠道上皮吸收进入血液循环[9-10]，因此可以通过口服来发挥溶栓作用。除了上述的溶抗栓功效，纳豆激酶还对高血压、阿尔茨海默症和玻璃体视网膜病变等疾病具有良好的疗效[11]。

传统上，纳豆激酶均是经过固态发酵获得。目前商业化生产的纳豆激酶固态发酵工艺多基于日本纳豆的发酵工艺，发酵基质也是以黄豆为主。通过固态发酵的纳豆激酶产品可以作为发酵食品食用，也可通过进一步分离提取制备不同级别的纳豆激酶类产品(如纳豆胶囊和纳豆激酶胶囊)。目前，商业化应用的固态发酵工艺的纳豆激酶活性一般能达到 20～100 FU/g[12]。然而，大规模固态发酵生产中存在物料灭菌不彻底，生产周期长，生物量浓度、pH、湿度等各项参数指标不易在线检测，散热、发酵调控及发酵终点等问题未能得到很好的解决，严重影响菌体的生长和酶的产量，并导致不同批次的产量差异大，生产效率低。相比之下，液态发酵具有传质均匀，发酵过程检测技术成熟、可控，能够实现自动连续化和易于放大等优势。因此研究人员转而探索液态发酵生产的方法。在过去的20年中，尽管国内外有关纳豆激酶液态发酵的研究已有许多报道，但发酵产量相对较低。课题组对纳豆激酶液态发酵的方法和策略进行了归纳和总结，并对该领域存在的问题进行探讨，期望为纳豆激酶的高效生产和广泛应用提供参考。

1 高产纳豆激酶菌株的选育

1.1 传统诱变育种

传统诱变育种的方法由于操作简单、突变率高、变异谱广等的优点，目前仍是最为常用的育种方法。MOHANASRINIVASAN等[13]将芽孢杆菌菌株SFN01的菌落悬浮于PBS缓冲液中，并在波长254 nm的紫外线下分别照射2.5、5、7.5、10 min。诱变后的突变菌株培养后，经硫酸铵沉淀发酵液上清得到纳豆激酶样品。用Holmstorm法测定样品活性，经过紫外诱变5 min和10 min的突变菌株，表现出了比出发菌株SFN01更高的纳豆激酶活性。余功保[14]将纳豆芽孢杆菌悬液均匀涂布于琼脂平板，用紫外灯照射筛选到了比原始菌株酶活力高的43个菌株，进一步筛选得到了产纳豆激酶最高的BSN-3菌株，诱变后的纳豆激酶酶活为1 120 IU/mL，比原始菌株的酶活提高了313%。

离子注入法是指通过离子束轰击菌种孢子，将离子注入孢子内，经过生化反应后离子取代DNA和RNA碱基中的离子，改变碱基的分子基团，从而使部分基因改变达到基因突变的方法。离子注入法兼有辐射诱变和化学诱变的特点，且同时存在能量传递、动量交换、离子沉积和电荷积累过程，可引起细胞遗传物质发生非致死性局部突变。其损伤轻、突变谱广、诱变效果显著，被广泛地应用于微生物诱变育种[15]。常用于诱变的离子有N+、H+、Ar+等，其中N+的诱变效率最高。高宏[16]将出发菌株枯草芽孢杆菌培养至对数期得到菌体悬浮液，然后涂布于无菌圆形培养皿内。将培养皿放入低能加速器的靶室内，进行N+注入诱变(能量20 keV，射入剂量(30～200)×2.6×1013ion/cm2)。随后经过酪蛋白琼脂平板初筛、摇瓶复筛和传代，获得1株高产的枯草芽孢杆菌XZ1125，比原始菌株的酶活力提高了160%。张勇[17]用N+作为诱变剂，以致死率为80%的诱变剂量作为最佳剂量，获得了高产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌，其纤溶酶活力达到了1 210 IU/mL，比出发菌株提高了50.13%。这些研究结果表明，使用离子注入的诱变方法筛选菌株，可极大地提高筛选效率，更易于得到特异性强的高产菌株。

60Co-γ射线是一种高能电磁波，可通过γ射线高能量产生电离作用，直接或间接改变DNA的结构，达到基因突变的目的。该操作方法具有高突变率和宽突变谱的特点。李淑英等[18]用60Co-γ 射线诱变纳豆激酶生产菌BSNK-5，考察不同辐照剂量下对菌株正突变率的影响，得出在辐照剂量800 Gy的条件下，正突变率最大，高达45%。共得到了11株活性提高的纳豆激酶突变菌株。

在诱变过程中，由于使用一种诱变剂对基因的诱变作用位点有限，可能只作用于单一的位置，诱变效果“钝化”，使正突变率下降。因此使用不同诱变机制的诱变剂交替处理，可提高变异率。关志炜[19]将枯草芽孢杆菌纳豆亚种NT-6的菌悬液用含适宜浓度的盐酸羟胺液体种子培养基诱变，再进行紫外诱变，得到了1株突变菌株，比出发菌株的产酶能力提高了68%。不同的诱变手段可能对DNA的作用位点不同。实验中用盐酸羟胺和紫外线这两种诱变方式处理，可能引起NT-6基因组上的不同位点的突变，从而使复合诱变起到协同效应。WANG等[20]以枯草芽孢杆菌LD-8作为出发菌株，首先采用紫外线诱变，筛选出具有较高纤溶活性的突变体枯草芽孢杆菌LD-85，再进一步用NTG(N-甲基-N′-亚硝基-亚硝基胍)对LD-85进行诱变。经琼脂平板筛选，得到具有较高活性的突变菌株LD-854。最后将1mL的枯草芽孢杆菌LD-854的细胞悬浮液用60Co-γ射线辐射诱变。通过UV、NTG和60Co-γ射线复合诱变的方法，最终获得了纤溶活性为3 980 IU/mL的突变菌株LD-8547，比起始菌株高出约190%。进一步检测其稳定性，显示经过连续生长4代后，其高产量特征是稳定的。由此可见，诱变选育对于高产量菌株筛选是行之有效的。然而，相关诱变机制的研究却尚未开展。因此，加强这方面的研究将对高效获得高产纳豆激酶的生产菌株起到极大的促进作用。

1.2 分子育种

随着分子生物技术的发展，构建高效生产纳豆激酶的工程菌也成为了一种提高酶产量的有效方法[21]。自从日本学者NAKAMURA[4]首次克隆纳豆激酶的基因aprN以来，使得利用基因工程技术提高纳豆激酶产量和活性成为了可能。目前，已有多例纳豆激酶基因的克隆并表达在各种宿主中的报道。表达宿主包括枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸乳球菌和草地贪夜蛾昆虫细胞等[11,22-24]。武汉大学的CAI等[25]首次利用直接进化的方法，分别对来自不同芽孢杆菌中的3个同源基因同源重组产生1个基因突变库，经过同源重组和高通量筛选后，突变体的纳豆激酶催化活性比野生型高2.3倍。WEI等[26]为了在地衣芽胞杆菌中提高纳豆激酶的活性和产量，构建了敲除载体，利用载体敲除10个编码胞外酶基因、鞭毛蛋白基因和淀粉酶基因。在此基础上，研究了不同信号肽对提高纳豆激酶活性的作用，使最高酶产量达到33.83 FU/mL。CHEN[27]通过金黄色葡萄球菌质粒pUB110与大肠杆菌质粒pUC18融合构建穿梭载体，并用于在枯草芽孢杆菌中表达纳豆激酶，使重组的纳豆激酶产量提高了2倍以上。WANG等[28]构建了多重基因缺失突变体LM2531，抑制了细胞裂解，显著增加了枯草芽孢杆菌的生物量和重组蛋白的产生。与野生菌株相比，工程菌株LM2531产生分泌的纳豆激酶增加了2.6倍。刘北域[29]采用碱性蛋白酶缺陷型工程菌为表达宿主，减少了发酵液中与纳豆激酶性质相近的杂蛋白，这不仅提高了重组纳豆激酶的产量，而且缩短了其分离纯化流程，降低了成本。经分离纯化后，每升发酵液可产100 mg纯度为95%的纳豆激酶，其比活性达到12 000 IU/mg。由于分子育种的方法传递遗传信息量较大，目的性强，是选育菌种的有效手段，值得推广应用。

2 培养基优化

2.1 碳源和氮源的影响

碳源和氮源是微生物生长以及各种初级和次级代谢最主要的营养成分。碳源为微生物的生长代谢提供必需的能量，氮源则是构成蛋白和核酸等生物大分子的重要组成部分。LIU[30]考察了5种碳源(葡萄糖、麦芽糖、木糖、甘油、蔗糖)和6种氮源(大豆蛋白胨、豆渣、硫酸铵、硝酸钠、谷氨酸钠、酪蛋白)对枯草芽孢杆菌生长及对纳豆激酶合成的影响。结果表明，对于纳豆激酶的生产，最佳的碳源和氮源分别为麦芽糖和大豆蛋白胨。随后通过中心复合设计(CCD)和响应曲面法(RSM)，确定了最佳培养基成分和用量。优化后的培养基使纳豆激酶活性达到1 300 IU/mL，比初始培养基提高了6倍。BERENJIA等[31]利用中心复合面设计实验，研究了碳源和氮源对纳豆枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶的影响。结果提示，用6%酵母提取物，1.2%大豆蛋白胨和6%甘油组成的优化培养基发酵获得纳豆激酶活性为587 IU/mL。其中甘油作为碳源显著促进了细胞密度的增加，而大豆蛋白胨，酵母提取物及其混合物作为有效的氮源，促进了纳豆激酶的生物合成。这种协同效应主要是由于其提供了对细胞代谢和酶合成至关重要的必需氨基酸。DEEPAK等[32]采用响应面法和中心复合旋转设计(CCRD)研究了培养基中4个变量葡萄糖、蛋白胨、CaCl2和MgSO4对枯草芽孢杆菌生产纳豆激酶的影响。结果分析表明，只有蛋白胨对纳豆激酶产量有显著影响。优化后的培养基生产纳豆激酶，产量比初始水平提高了2倍，达到了3 194.25 IU/mL。

基于降低发酵生产成本，利用低廉的食品工业副产品或农业废弃物作为生产纳豆激酶的培养基，引起人们极大的关注。KU等[33]利用色拉油生产中的副产物脱脂大豆作为氮源，价格低廉的葡萄糖作为碳源。通过RSM优化，确定了产纳豆激酶的最优培养基组成为脱脂大豆29.3 g/L，葡萄糖17.5 g/L，按体积质量系数4%的接种密度，纳豆激酶的产量达到13.78 SU/mL。WANG等[34]尝试利用虾壳废弃物作为唯一的碳源和氮源对假单胞菌(Pseudomonassp. TKU015)发酵，结果发现虾壳废弃物可以作为该菌生长和生产纳豆激酶的培养基。随后，该研究组发现虾壳废弃物也可用于枯草芽孢杆菌TKU007生产纳豆激酶，并最终纯化获得活性为27.5 FU/mg的纳豆激酶[35]。

以上研究结果表明，不同的菌种对碳源和氮源的偏好不同，所以针对不同菌株进行碳源和氮源的优化十分必要。另外，中心复合设计、响应曲面设计、Plackett-Burman和Box-Behnken等实验设计方法[36-38]的应用可以同时对各种不同的碳氮源进行快速、有效的优化，获得适合菌株产酶的最佳条件。

2.2 无机盐的影响

除了碳源和氮源两种主要的培养基成分外，一些金属离子，如钙、钾、钠、镁、锌等无机盐对微生物的生长代谢同样具有必不可少的作用。例如，磷是核酸和蛋白质必不可少的成分，在代谢途径的调节中起着重要的作用；镁可作为某些酶的辅因子或激活剂，调节酶的活性；硫是某些辅酶的活性剂和含硫氨基酸的成分；锰可促进芽孢的生成；钙是某些胞外酶的稳定剂；钠离子可刺激枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的分泌[39]。在培养基中添加金属离子在一定程度上能够促进纳豆激酶的合成。

谢秋玲[40]通过正交试验比较了CaCl2、MgSO4、MnCl2、K2HPO4、KH2PO4和Na2HPO4对纳豆菌产纳豆激酶的影响，发现Ca2+对酶的产量影响最大。在不添加Ca2+的情况下，产酶量较低。这说明Ca2+有利于纳豆激酶的合成，但作者未对相关的机理作进一步研究。Mg2+的添加对酶合成的影响不大，可能是由于菌株对其需求量较少，氮源大豆蛋白胨中存在一定量的Mg2+，已经满足了细菌的需求。Mn2+不利于产酶，是否因为其影响芽孢的生成尚待考察。最终优化后的条件，使纳豆激酶的产量达到了759 IU/mL。LIU等[30]也发现培养基中Ca2+的存在可以促进纳豆激酶的合成。CHEN等[41]在基因重组枯草芽孢菌株WB700/pU4-NAT2的培养基中添加10 μmol/L含10种不同金属离子[Al2(SO4)3, CoCl2, CuCl2,MnCl2, NiCl2, Na2MoO4, FeCl2, CaCl2,MgCl2和ZnSO4]的混合物，使纳豆激酶的产量增加了2.2倍。作者推断，由于纳豆激酶在从胞内向胞外分泌的过程中，纳豆激酶被结合在细胞膜上，引起了反馈抑制作用，使纳豆激酶的合成受到限制；而金属离子的添加取代了纳豆激酶和细胞膜结合，使纳豆激酶顺利分泌至胞外，胞内得以继续合成纳豆激酶。虽然这些推测有一定的道理，但是作者缺乏有力的证据。此外，由于作者添加的是混合离子，难以说明到底哪种离子在发挥作用。总之，研究发现不同的金属离子对细胞的生长和纳豆激酶的产量有不同的影响，但是它们的影响机制尚有待深入研究。

3 发酵条件优化

液体发酵的条件主要包括温度、装液量、初始pH值、接种量、转速和溶氧等。影响纳豆激酶产量的主要发酵条件有pH，发酵温度和溶氧。

3.1 pH

pH既可以影响菌体的生长，也可以影响纳豆激酶的生产。朱向辉[42]详细研究了在培养基pH为6.0～10.0的条件下，纳豆芽孢杆菌的生长和产酶情况。结果表明，适宜细胞生长和产酶的初始pH值分别为pH9.0和pH7.0。偏酸性的条件既不利于菌体生长，也不利于产酶。RASAGNYA[43]在摇瓶中考察了初始pH对纳豆枯草杆菌发酵生产纳豆激酶的影响。结果表明，pH7.5时纳豆枯草杆菌的产酶量最高，pH值高于或低于pH7.5，均不利于产酶。由此可见，培养基pH条件中性或近中性是适合纳豆激酶发酵生产的。

3.2 温度

任何微生物都有最佳的生长温度范围，但此温度不一定是目标代谢物最适合的生产温度。在某些情况下，利用变温控制策略(即在不同发酵阶段采取不同温度)可以提高产量。谢秋玲[40]研究了30～45 ℃范围纳豆枯草杆菌的生长和产酶过程，发现较高温度(40 ℃)有利于细菌生长，而产酶的最佳温度为35 ℃。熊晓辉等[44]考察了发酵温度在25～35 ℃范围内对枯草芽孢杆菌生产纳豆激酶的影响，结果表明在30 ℃时酶产量最高，达到了2 000 IU/mL，比35 ℃时提高了大约40.86%。王正刚等[45]研究的Bacillusnatto6 菌株在发酵温度为 37 ℃的条件下产生的纳豆激酶活性最高。总的来说，对枯草芽孢杆菌而言，其生产纳豆激酶的合适范围一般在30～37 ℃。

3.3 溶氧

纳豆激酶生产菌属于好氧菌，在纳豆激酶发酵生产过程中，溶氧对纳豆激酶的产量影响很大。王万春等[46]在250 mL的摇瓶中考察了在相同的转速下，不同体积的装液量(15、20、25、30、35、40 mL)对纳豆激酶发酵生产的影响，结果发现产酶量随着装液量的增加而降低，当装液量为15 mL时，酶产量为890.73 IU/mL，而当装液量提高至40 mL时，酶产量下降了23%。这表明，溶氧对酶产量有着显著的影响，溶氧降低，酶产量也随之下降。UNREAN等[47]通过构建枯草芽孢杆菌反应网络模型，定量研究了无氧和有氧条件下枯草芽孢杆菌的产酶情况，发现氧是纳豆激酶合成的决定性因素。上述结果提示，在纳豆激酶的发酵生产过程中，通过溶氧水平的调节，将有可能大幅度提高酶的产量。相比于优化培养基，目前有关溶氧对纳豆激酶合成影响的研究较少，且缺乏系统性，有必要加强溶氧或氧供应方面的研究。

4 培养方式

培养方式可对细胞生长和产物的产量造成显著的影响。目前，纳豆激酶的生产主要有分批培养和补料分批培养两种方式。

CHO等[48]在筛选氮源的基础上，考察了培养方式对纳豆激酶产量的影响。研究表明, 采用补料分批培养策略，以培养基中的pH变化为指标来判断补料时间，使葡萄糖浓度始终维持在1g/L的条件下，在发酵的第19 h时，纳豆激酶产量达到7 100 IU/mL，是分批培养的酶产量的2.1倍。随后，该研究组利用pH-stat分批补料的培养方式，当发酵液pH由于葡萄糖的消耗而高于pH7.0时开始加入葡萄糖和蛋白胨的浓缩混合溶液，最后纳豆激酶活性达到14 500 IU/mL，比分批培养提高了4.3倍[49]。祝亚娇等[50]以构建的产纳豆激酶的地衣芽胞杆菌工程菌为研究对象，在5 L的发酵罐考察了分批培养和补料分批培养对纳豆激酶产量的影响。结果发现，当以0.25 mL/min的速率补加质量浓度为0.2 g/mL的葡萄糖溶液时，纳豆激酶的产量比不补料时提高了13%，说明补加适当质量浓度的葡萄糖有利于纳豆激酶的合成，与前面的报道相一致。但其补加氮源却对酶的产量无影响，这与前人的结果不同。作者认为一方面可能是由于他们的研究中所用发酵培养基中氮源是充足的，故不需补加；另一方面可能由于他们的研究中所用基因工程菌与野生菌存在差异，氮源对工程菌分泌纳豆激酶并不是关键因素。由此可见，适当的补料策略对纳豆激酶产量的提高是有益的。

5 展望

自从纳豆激酶及其强大的溶栓活性被发现以来，其广泛应用于医药、食品和保健品行业，市场需求日益增加。虽然目前国内外针对菌株选育、培养基、发酵条件、基因工程等方面已展开了大量的研究，但是仍然存在纳豆激酶产量和酶活偏低等问题。此外，对整个纳豆激酶发酵过程代谢调控的研究还相对较少，对影响纳豆激酶产量、生产效率和生物过程放大等因素的研究还不够深入。因此，应对以下几个方面的问题进行更为深入的研究：(1)纳豆激酶生物合成的机理及代谢调控；(2)影响发酵过程关键因素的作用机理；(3)发酵放大的关键因子的确定及放大规律；(4)发酵过程中多层次、多水平的系统生物学。

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Researchprogressofliquidfermentationofnattokinase

WU Yan1,2,LI Ying-bo2*,LIANG Xiang-feng3, LIU Hui-zhou2, XIAO Jian-hui1*

1(Institute of Medicinal Biotechnology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China)2(Key Laboratory of Green Process and Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)3(Key Laboratory of Bio-based Material, Chinese Academy of Sciences, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Qingdao 266101, China)

Nattokinase(EC3.4.21.62)is a kind of serine proteinase that has potent thrombolytic activity. Compared to the first-line thrombolytic drugs(urokinase and streprokinase), nattokinase possesses several advantages such as safety, low cost, long half-life and easy oral administration. Therefore, nattokinase has been receiving increasing attention for its use as thrombolytic agent or health care product.The solid and liquid fermentation sare usually employed for the nattokinase production.However, the fermentation titer of nattokinase is still poor, and can meet the requirement of the market. In this review, the strain breeding, medium optimization, fermentation conditions optimization, and culture mode of nattokinase have been outlined and summarized, which would provide valuable reference for the industrial production and application of nattokinase.

nattokinase; microorganism; liquid fermentation; thrombolytic drug

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014789

硕士研究生(李英波副研究员，肖建辉教授为通讯作者,E-mail:ybli@ipe.ac.cn; jianhuixiao@126.com)。

中国科学院绿色过程与工程实验室青年基金(GPE-2013-3)；贵州省高层次创新型人才支撑计划(QKH-RC-20154028)；国家自然科学基金(81460156)

2017-05-17，改回日期2017-07-05