何然+汪宏锦+周莹+李晶晶+徐晓玉

[摘要]觀察四物汤对幼鼠缺铁性贫血的改善作用及其对铁代谢调节的机制。该研究用低铁饲料饲喂断乳的SD大鼠2周后，筛选出血红蛋白少于75 g·L^-1的大鼠，随机分为模型组，琥珀酸亚铁组（50 mg·kg^-1），四物汤组（4，8，16 g·kg^-1），灌胃给药4周。制作血涂片和肝脏HE染色，测定血常规、血清铁、总铁结合力、血清铁蛋白、肝脏铁、血清铁调素和肝脏铁调素含量，测定肝脏铁蛋白、转铁蛋白和转铁蛋白受体1的表达。结果发现，与正常组相比，模型组活动量减少，耳廓和脚趾呈苍白色；红细胞数量减少，体积变小，中央淡染区扩大；体重和各血常规参数显著降低；肝脏呈浅红色，中央静脉周围的肝细胞索分界不清晰，排列杂乱；血清铁、血清铁蛋白、肝脏铁含量和肝脏铁蛋白表达显著降低；总铁结合力、血清铁调素、肝脏铁调素、转铁蛋白和转铁蛋白受体1表达显著升高，显示造模成功。与模型组相比，四物汤组活动量增多，耳廓和脚趾色泽红润；红细胞数量增多，体积变大，中央淡染区缩小；体重和血常规各参数显著升高；肝脏颜色变红，中央静脉周围的肝细胞索分界较清晰，排列趋于整齐；血清铁、血清铁蛋白、肝脏铁含量和肝脏铁蛋白表达显著升高；总铁结合力、血清铁调素、肝脏铁调素、转铁蛋白和转铁蛋白受体1表达显著降低。研究表明，四物汤对幼鼠缺铁性贫血具有较好的改善作用，其机制可能与改善铁调素对铁代谢的调节有关。

[关键词] 缺铁性贫血； 四物汤； 幼鼠； 铁代谢； 铁调素

[Abstract] To investigate the effect of Siwu decoction on improving iron deficiency anemia in infant rats and observe its regulatory effects on iron metabolism. SD rats were fed with low iron fodder for 2 weeks， and then the rats with hemoglobin level less than 75 g·L^-1 were screened out and randomly divided into model group， Ferrous succinate 50 mg·kg^-1 group， Siwu decoction 4 g·kg^-1， 8 g·kg^-1 and 16 g·kg^-1 groups. After 4 weeks′ gavage administration， Wright-Giemsa′s staining of blood smear and HE staining of the livers were conducted， and all rats were tested for blood routine， serum iron， total iron binding capacity， serum ferritin， serum hepcidin and liver hepcidin. The expression levels of liver ferritin， transferrin and transferrin receptor 1 were also detected. The results showed that as compared with normal group， the activity level of model group was decreased， and the color and lustre of auricles and toes were pale white； the number of red blood cells was decreased； the volume was smaller， with an increased zone of central pallor； the body weight and blood routine parameters were decreased significantly； the livers were pale red， and the hepatic cords around thecentral veins were unclear and misaligned； the serum iron， serum ferritin， liver iron levels and the expression of liver ferritin were decreased significantly； the total iron binding capacity， serum hepcidin， liver hepcidin， the expression levels of liver transferrin and transferrin receptor 1 were significantly increased， indicating successful establishment of models.As compared with the model group， activity was increased in Siwu decoction group； the color and lustre of auricles and toes were ruddy； the number of red blood cells was increased； the volume was larger， with a decreased zone of central pallor； the body weight and blood routine parameters were increased significantly； the livers were red， hepatic cords around the central veins were clear and aligned；the serum iron， serum ferritin， liver iron levels and the expression of liver ferritin were significantly increased， the total iron binding capacity， serum hepcidin， liver hepcidin， the expression of liver transferrin and transferrin receptor 1 were decreased significantly. The results demonstrated that Siwu decoction had a certain effect on improving iron deficiency anemia in infant rats， and the mechanism may be associated with the regulatory effect of hepcidin iron metabolism.

[Key words] iron deficiency anemia； Siwu decoction； infant rats； iron metabolism； hepcidin

贫血影响着世界上大约三分之一人口的健康，其中有一半是铁缺乏造成的^[1]。缺铁性贫血的发病率在经济不发达地区的婴幼儿、育龄妇女中明显增高^[2]。目前，口服铁剂被认为是最佳的治疗手段^[1]，但口服铁剂存在一些副作用，如常见的胃肠道反应等；并且过量补充铁剂会造成机体铁超载，诱发肝脏、心血管损害和神经退行性病变^[3]。

四物汤来自《仙授理伤续断秘方》，由川芎、当归、熟地黄和白芍组成，是经典的中医补血方剂。但以往对四物汤的研究主要是通过放血、辐射损伤或注射环磷酰胺诱导骨髓抑制建立成年大、小鼠血虚模型，来观察其在造血系统^[4-6]、免疫调节^[7-8]和抗射线损伤^[9-11]等方面的作用，而未见四物汤对幼年缺铁性贫血大鼠及对铁代谢调节的研究。本实验拟研究四物汤对幼鼠缺铁性贫血的改善作用及其对铁代谢的调节机制，为将四物汤应用于治疗妇女及婴幼儿贫血提供部分临床前试验依据。

1 材料

1.1 动物与饲料 80只SPF级21 d断乳SD大鼠，雌雄各半，购自重庆市中药研究院实验动物研究所，生产许可证号SCXK（渝）2012-0006，实验动物质量合格证号No.0001728；饲养于西南大学药学院实验动物中心，实验动物使用许可证号SYXK（渝）2014-0002。大鼠的饲养和使用均符合中国《实验动物管理条例》。AIN-93G标准饲料（含铁量约为0.004 5%）和AIN-93G低铁饲料（含铁量约为0.000 4%）均购自南通特洛菲饲料科技有限公司。

1.2 药材与试剂 四物汤由川芎-当归-熟地黄-白芍按2∶3∶4∶3比例组成。药材均购自重庆鑫斛药房连锁有限公司，经西南大学药学院齐红艺教授鉴定均为正品。琥珀酸亚铁片购自四川奥邦药业有限公司。快速瑞吉氏染液、血清铁、总铁结合力和组织铁测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。铁蛋白和铁调素酶联免疫试剂盒购自上海优选生物科技有限公司。RIPA裂解液、PMSF和BCA蛋白定量测定试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。铁蛋白（10727-1-AP）、转铁蛋白（17435-1-AP）和转铁蛋白受体1（10084-2-AP）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司。山羊抗兔IgG（bs-0295G）抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 仪器 旋转蒸发器（RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂）；全自动血液细胞分析仪（BC-2800 Vet，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；病理切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；台式低温高速离心机（5417R，德国Eppendorf生命科学有限公司）；酶标仪（Elx800，美国BioTek仪器有限公司）；电泳槽和转印槽（美国BIO-RAD生命医学产品有限公司）；全自动化学发光图像分析系统（Tanon5200，上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 四物汤提取物配制 称取川芎20 g、当归30 g、熟地黄40 g、白芍30 g，添加10倍量水，浸泡30 min后，于中药煎药壶中煎煮60 min，用纱布过滤。残渣中再添加10倍量水，再煎煮60 min后过滤。合并滤液并旋转蒸发浓缩至含生药浓度1.6，0.8，0.4 g·mL^-1，4 ℃存放，备用。

2.2 造模与分组 将80只21 d断乳大鼠适应性饲养1周，随机分为正常组10只和造模组70只，编号后饲养于不锈钢笼中。正常组饲喂标准饲料，造模组饲喂低铁饲料，自由饮去离子水，饲养过程中尽量避免铁接触。2周后，造模组大鼠内眦静脉采血200 μL，EDTA抗凝后测定血常规，筛选出50只血红蛋白含量少于75 g·L^-1的大鼠作为造模成功大鼠。将其雌雄各半随机分为模型组，琥珀酸亚铁50 mg·kg^-1，四物汤4，8，16 g·kg^-1组，每组10只。

2.3 给药 除正常组和模型组灌胃等体积水外，其余4组分别灌胃设定剂量的琥珀酸亚铁或四物汤提取物，连续给药4周。给药期间，各组大鼠继续饲喂标准或低铁饲料，自由饮去离子水。

2.4 大鼠一般情况观察和体重测定 分别观察各组大鼠精神状态、活动、毛色、耳廓、腳趾等情况，用天平称量大鼠体重，并比较各组差异。

2.5 组织样本制备 给药4周后，各组大鼠禁食不禁水12 h，内眦静脉采血1.5 mL，EDTA抗凝后备测。另采血1.5 mL，不抗凝，静置24 h后，3 000 r·min^-1离心10 min，分离得到血清，-80 ℃保存。1%戊巴比妥钠按40 mg·kg^-1剂量腹腔注射麻醉后，冰上分离肝脏，-80 ℃保存。

2.6 血涂片染色 滴加1滴血液于干净的载玻片上，推片，待血膜干燥后，严格按照说明书进行瑞氏-吉姆萨染色，镜检。

2.7 肝脏HE染色 将肝脏固定于4%多聚甲醛24 h以上，梯度脱水后包埋，行石蜡切片，片厚5 μm，严格按照说明书进行HE染色，镜检。

2.8 生化指标检测 采用全自动血液细胞分析仪测定血常规参数。采用比色法严格按照说明书测定血清铁，总铁结合力和肝脏铁含量。采用酶联免疫吸附测定法严格按照说明书测定血清铁蛋白，血清铁调素和肝脏铁调素含量。

2.9 Western blot检测 将肝脏置于4 ℃预冷的生理盐水中，剪碎，加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃ 13 000 r·min^-1离心5 min，取上清液，严格按照说明书采用BCA法测定蛋白浓度。用去离子水将各蛋白样品调至等浓度，加入上样缓冲液，沸水浴5 min，冷却，制备10% SDS-PAGE凝胶后，加入等量蛋白样品电泳分离蛋白后，用湿法将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4 ℃孵育一抗（铁蛋白 1∶500，转铁蛋白 1∶200，转铁蛋白受体1 1∶500）过夜，TBST洗膜4次，每次10 min。室温孵育二抗（山羊抗兔IgG 1∶2 000）1 h，再用TBST洗膜4次，每次10 min。用ECL孵育后在化学发光成像系统中显影拍照，用Image J对图片进行分析。

2.10 统计学分析 试验重复3次，所得数据用SPSS 19.0进行分析，数值用±s表示。组间数据比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有显著性。

3 结果

3.1 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠的生长情况 造模2周后，与正常组相比，模型组活动量减少，耳廓和脚趾呈苍白色，體重显著降低（P<0.01）。给药期间，与模型组相比，四物汤各组的活动量增多，耳廓和脚趾色泽红润，见图1，2。与模型组相比，给药12 d后，四物汤16 g·kg^-1组的体重显著升高（P<0.05），给药16 d后，四物汤4，8 g·kg^-1组的体重均显著升高（P<0.05），见图3。

3.2 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠红细胞形态 与正常组相比，模型组的红细胞数量减少，体积变小，中央淡染区扩大。与模型组相比，四物汤各组的红细胞数量增多，体积变大，中央淡染区缩小，见图4。

3.3 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠肝脏外观和组织形态 与正常组相比，模型组肝脏呈浅红色，中央静脉周围的肝细胞索分界不清晰，排列杂乱。与模型组相比，四物汤各组肝脏颜色逐渐变红，中央静脉周围的肝细胞索分界较清晰，排列趋于整齐，见图5，6。

3.4 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠血常规相关指标 与正常组相比，模型组的红细胞数量（RBC），血红蛋白含量（Hb），红细胞比容（HCT），平均红细胞体积（MCV），平均红细胞血红蛋白量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）均显著降低（P<0.01）。与模型组相比，四物汤4，8，16 g·kg^-1组的RBC，Hb，HCT和MCHC均显著升高（P<0.05，P<0.01）；8，16 g·kg^-1组的MCV和MCH均显著升高（P<0.05，P<0.01）。见表1，2。

3.5 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠血清铁、总铁结合力和血清铁蛋白含量 与正常组相比，模型组的血清铁和血清铁蛋白含量均显著降低（P<0.01），总铁结合力显著升高（P<0.05）。与模型组相比，四物汤4 g·kg^-1组的血清铁蛋白显著升高（P<0.05）；8 g·kg^-1组的血清铁蛋白显著升高，总铁结合力显著降低（P<0.05）；16 g·kg^-1组的血清铁和血清铁蛋白均显著升高（P<0.01），总铁结合力显著降低（P<0.05），见表3。

3.6 四物汤显著改善贫血大鼠幼鼠肝脏铁含量和肝脏铁蛋白、转铁蛋白及转铁蛋白受体1的表达 与正常组相比，模型组的肝脏铁含量和肝脏铁蛋白表达均显著降低（P<0.01）；转铁蛋白和转铁蛋白受体1表达均显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组相比，四物汤4，8，16 g·kg^-1组的肝脏铁含量均显著升高（P<0.05，P<0.01）；四物汤8，16 g·kg^-1组的肝脏铁蛋白表达均显著升高（P<0.01），转铁蛋白和转铁蛋白受体1表达均显著降低（P<0.05，P<0.01），见表4，图7。

3.7 四物汤显著降低贫血大鼠幼鼠血清铁调素和肝脏铁调素含量 与正常组相比，模型组的血清铁调素和肝脏铁调素均显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组相比，四物汤4，8，16 g·kg^-1组的血清铁调素均显著降低（P<0.05，P<0.01）；四物汤8，16 g·kg^-1组的肝脏铁调素均显著降低（P<0.05），见表5。

4 讨论

4.1 缺铁性贫血的治疗手段有待提高 缺铁性贫血是指缺铁引起的小细胞低色素性贫血及相关的缺铁异常。婴幼儿需铁量较大，常因添加辅食不当造成缺铁性贫血。青少年偏食也易致缺铁性贫血^[2]。口服铁剂是治疗缺铁性贫血的首选方式，但是目前在口服铁剂治疗或预防缺铁性贫血的用药剂量、用药时间和停药时间等方面存在较多争议^[12]。临床上使用的口服铁剂主要有琥珀酸亚铁，硫酸亚铁等，这些亚铁类补铁剂都会对婴幼儿产生较为严重的消化道反应，如恶心，便秘，腹泻，腹部不适和口腔异味等^[13]。并且，若补充铁剂过量，又可能引起铁超载，导致氧化应激，增加慢性病的危险^[14]。因此，寻找新的治疗缺铁性贫血的药物很有必要。

4.2 补血名方四物汤改善贫血的作用机制与调节铁代谢有关 四物汤作为经典的中医补血方剂，具有补血调血的功用，主治营血虚滞证。早在20世纪90年代初，龚跃新等^[15]就对四君子汤、四物汤和八珍汤中的微量元素进行了测定，结果表明四物汤中的含铁量最高，这为缺铁性贫血患者增加了铁的来源。但同时他们也指出，四物汤补血的功效并不仅仅是通过补充铁元素，而是多种作用协同的结果。四物汤的有效成分主要包括多糖、阿魏酸、川芎嗪和芍药苷等^[16]，有研究^[17]发现，当归多糖与高价铁形成复合物后，可以升高缺铁性贫血大鼠RBC，Hb，HCT和全血铁含量。当归多糖还可以抑制转铁蛋白和铁调素的表达^[18]，提示四物汤可能具有调节铁代谢的作用。本研究首次证明了四物汤具有较好的治疗幼鼠缺铁性贫血的作用，并证明了能显著纠正由于机体功能状态铁丢失时造成的血清铁降低和总铁结合力升高。另一方面，铁蛋白是人体铁储备的主要形式之一^[19]，转铁蛋白是机体中转运铁的重要方式，四物汤可以显著升高血清铁蛋白和肝脏铁蛋白，抑制肝脏转铁蛋白和转铁蛋白受体的表达，并且可能通过抑制铁调素的表达，改善铁缺乏状况，对幼鼠缺铁性贫血模型的铁代谢紊乱起到显著的改善作用。

4.3 幼鼠低铁饲料造模结果更加接近临床实际 在本研究中，作者采用21 d断乳大鼠作为试验对象，以模拟婴幼儿缺铁性贫血。在模型的建立过程中，通过自由饮去离子水尽量减少铁接触，并且仅通过低铁饲料饲喂，未采取放血，尽可能与临床实际相符。其结果，模型组活动量减少，体重显著降低，耳廓和脚趾呈苍白色，肝脏呈浅红色，呈小细胞低色素性贫血，血清铁蛋白显著降低，有缺铁的依据，符合缺铁性贫血的诊断标准^[2]。

综上所述，四物汤对幼鼠缺铁性贫血具有较好的改善作用，并且其对铁代谢的调节可能与铁调素有关，其进一步的机制还有待深入研究。

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[责任编辑 张宁宁]