仇保丰 董蓉莲 宋鸿雁 顾炳泉 +景瑾 刘文斌 +邵义祥 +高逢结 +李建

摘要：根据GenBank中收录的柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白S3a基因序列，利用计算机软件设计1对引物，从纯化的柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子中提取总RNA，然后应用RT-PCR技术扩增出约810 bp的产物，将其连入pMD18-T载体，经双酶切和PCR鉴定正确后，进一步进行DNA序列测定。将本研究测序结果与GenBank收录的柔嫩艾美耳球虫S3a基因进行比对，发现两序列间有6个碱基发生突变，其中3个为无义突变，其余为有义突变，同源性为979%；本研究扩增的S3a基因包含了一个全长795 bp的完整开放阅读框（ORF），编码264个氨基酸，蛋白分子量约为29.9 KD，ORF碱基同源性为99.0%，推导氨基酸序列同源性为98.1%。将本研究克隆的核糖体蛋白S3a基因与GenBank中收录的人和哺乳动物、植物、真菌、禽鸟等共15种真核生物的核糖体蛋白S3a基因进行比对发现，虽然本研究克隆和GenBank中收录的柔嫩艾美耳球虫S3a基因之间同源性最高，但是两者却与硕大利什曼原虫和布氏锥虫这2种原虫的S3a基因同源性较低，反而与禽鸟S3a基因的同源性较高。

关键词：柔嫩艾美耳球虫；S3a基因；克隆；分析

中图分类号： Q785文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0068-03

收稿日期：2015-09-27

基金项目：国家自然科学基金（编号：31301926）；江苏省自然科学基金（编号：BK20130388）。

作者简介：仇保丰（1978—），男，安徽长丰人，博士，兽医师，从事动物及动物产品病原体的检测及研究。Tel：（0513）68588403；E-mail：baofengqiu2008@163.com。

通信作者：宋鸿雁，博士，副教授，研究方向为实验动物学。E-mail：songhongyanv@ntu.edu.cn。

鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）S3a基因是从E. tenella第1代裂殖体λ ZapⅡ cDNA 文库中筛选出来的1种核糖体蛋白（EtS3a）基因，由于它与具有调节细胞周期进程和参与蛋白合成的哺乳动物核糖体蛋白fte-1、植物核糖体蛋白cyc-07和酵母菌核糖体蛋白MFT1均具有较高的同源性，且其mRNA仅在E. tenella裂殖体和裂殖子阶段能够检测到，故而推测EtS3a可能在激发E. tenella裂殖子和裂殖体发育、黏附和侵袭宿主细胞、适应环境变化等过程中发挥重要的调节作用[1]。除此之外，Cordeiro-Da-Silva等在研究中发现，硕大利什曼原虫（Leishmania major）的S3a蛋白还具有调节T细胞和B细胞活性，参与免疫调节的作用[2]。Zemzoumi等报道硕大利什曼原虫S3a蛋白可由胞内转运至胞外，并与被膜结合，具有保护抗原的特性[3]。但截止目前，国内外尚未发现关于E. tenella S3a基因克隆和分析的研究报道，这对进一步研究E. tenella S3a蛋白的生物学功能和免疫学意义等造成不利影响。本研究通过对鸡E. tenella江苏分离株的S3a基因进行克隆和分析，为相关研究工作者提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1球虫卵囊E. tenella卵囊分离自江苏某鸡场，由南通出入境检验检疫局有害生物检疫实验室鉴定并保存。

1.1.2试验鸡1日龄AA肉鸡购自江苏南通某商品鸡孵化场，饲养于严格消毒无球虫的笼舍中，饲喂的饲料中不含抗球虫药。

1.1.3试剂DEPC，购自Amresco公司；M-MLV和Oligo（dT）15 Primer，购自Promega公司；pMD18-T克隆载体、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 Marker、限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA胶回收试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2试验方法

1.2.1引物设计和合成根据GenBank中收录的E. tenella S3a基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计1对扩增引物：S3a-F，5′-A[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]ATGGCGGTCGGTAAGAACAAG-3′；S3a-R，5′-TT[ZZ（Z]GAATTC[ZZ）]TCAGACAGAGTCTTGCACAG-3′，画线部分为BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2cDNA模板的制备30只1日龄AA肉鸡饲养至14日龄，经口接种新鲜孢子化卵囊1×105 个/羽，接种后120 h杀鸡取盲肠。参考文献[4]的方法分离和纯化E. tenella第2代裂殖子，再采用一步法[5]提取总RNA并进行反转录，以反转录cDNA作为PCR模板。

1.2.3S3a基因的克隆及鉴定以“1.2.2”节制备的cDNA为模板，用特异性引物进行S3a基因的PCR扩增，PCR反应体系如下：10×Taq Buffer 2.5 μL，MgCl2 （25 mmol/L） 1.0 μL，dNTP Mix （10 mmol/L each） 0.5 μL，上、下游引物（50 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，滅菌双蒸水14.5 μL，cDNA模板5 μL。S3a基因的PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 55 s，57 ℃ 55 s，72 ℃ 55 s，35个循环，然后72 ℃延伸15 min。循环反应完毕后，将扩增产物中加入5 μL上样缓冲液在1%琼脂糖凝胶上电泳，结束后在紫外灯下观察结果。回收S3a基因目的条带、连接 pMD18-T载体并转化DH5α，用双酶切和PCR鉴定出阳性克隆，并挑取3个克隆送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.2.4S3a基因序列分析用DNAStar 4.0软件对S3a基因的测序结果进行编辑，分析开放阅读框（ORF）的碱基序列，并推导出编码蛋白的氨基酸序列。收集GenBank中报道E. tenella S3a基因序列，用MegAlign Clustal V软件对S3a基因的碱基序列和推导氨基酸序列进行比对和分析。最后将所得S3a基因测序结果输入http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进行网上比，同时分别选取原虫、真菌、植物、鸟类、人和其他哺乳动物的核糖体蛋白S3a基因，并用MEGA 6.06软件构建遗传进化发生树，分析了本研究克隆S3a基因和上述物种S3a基因之间的遗传进化关系。

2结果与分析

2.1S3a基因的克隆

提取E. tenella第2代裂殖子的总RNA并反转录，分别用S3a基因特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，发现第1、2、3泳道未能扩增出目的片段，第4泳道有约810 bp的目的条带（图1），与预期大小相吻合。切胶回收第4泳道的目的条带，连接pMD18-T载体并转化大肠埃希菌DH5α。

[TPQBF1.tif]

2.2S3a基因的鉴定

目的基因S3a连接T载体并转化DH5α后，提取质粒 T-S3a经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切鉴定和特异性引物的PCR鉴定，均能获得与预期结果一致的目的条带（图2和图3），挑取3个阳性克隆送宝生物工程（大连）有限公司测序并进行BLAST比对，结果显示，本研究所扩增的S3a基因与GenBank收录的E. tenella S3a基因同源性最高（达97.9%），说明本研究E. tenella S3a基因克隆成功。

2.3S3a基因序列分析

用DNAStar 4.0软件编辑S3a基因测序结果发现，上、下游引物间的碱基数量为810 bp，与预期大小一致。与GenBank中收录的E. tenella S3a全基因（登陆号：AF042107.1）比较发现，本研究扩增序列有6个碱基发现突变（分别为第332、357、420、459、520、526位，引物设计时人工突变的碱基未计算在内，下同），比较推导氨基酸序列发现，仅第332、520、526位碱基突变为有义突变，引起氨基酸序列第111、174和176位3个位点发生突变，其余为无义突变。将江苏株E. tenella S3a基因与GenBank收录序列的ORF进行比对，发现本[CM（25]研究扩增的江苏株E. tenella[KG*3]S3a基因包含了795[KG*3]bp的[CM）]

[FK（W10][TPQBF2.tif；S+3mm]

[FK（W10][TPQBF3.tif；S+3mm]

完整开放阅读框（ORF），编码蛋白为264个氨基酸，蛋白分子量约29.9 ku，两序列间ORF碱基同源性为99.0%，推导氨基酸序列同源性为98.1%。

已有研究表明，E. tenella S3a基因与哺乳动物核糖体蛋白fte-1、植物核糖体蛋白cyc-07和酵母菌核糖体蛋白MFT1均具有较高的同源性[1]。本研究收集了GenBank中人和哺乳动物、植物、真菌、鸟类共15种生物的核糖体蛋白S3a基因，其中包括E. tenella、Leishmania major和布氏锥虫（Trypanosoma brucei）3种原虫，人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）和家猫（Felis catus）3種哺乳动物，菠萝（Ananas comosus）、小麦（Triticum aestivum）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon） 3种植物，金雕东北亚种（Aquila chrysaetos canadensis）、游隼（Falco peregrinus）、灰冠鹤（Balearica regulorum gibbericeps）、欧洲普通杜鹃（Cuculus canorus）和火鸡（Meleagris gallopavo）5种禽鸟，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1种真菌，结合本研究克隆的S3a基因共同用MegAlign Clustal V软件进行分析，发现上述S3a基因间的同源性在35.0%～979%之间不等，总体表现是生物分类关系较近的物种，如不同种禽鸟之间S3a基因的同源性相对较高；而生物分类关系较远的不同物种间，如禽鸟类和植物之间，S3a基因的同源性较低。但例外的是，虽然本研究克隆和GenBank中收录的E. tenella S3a基因之间同源性最高，但是两者却与硕大利什曼原虫和布氏锥虫这2种原虫的同源性较低，反而与禽鸟S3a基因的同源性较高。接着用MEGA 6.06软件构建遗传进化发生树，也发现相同结果，即E. tenella S3a基因与禽鸟S3a基因分布在一个进化关系较近的分支上，而与硕大利什曼原虫和布氏锥虫这2种原虫所处的分支相距较远（图4）。进一步将E. tenella S3a基因序列输入GenBank进行Blast比对，也发现E. tenella S3a基因与多种禽鸟S3a基因之间的同源性远远高于其他物种的S3a基因，但为何会出现此结果，还需要进一步研究和探讨。

[FK（W17][TPQBF4.tif]

3讨论

真核生物核糖体蛋白S3a存在于40S核糖体亚基上，且位于大小核糖体亚基的接触面上，该部位是核糖体结合翻译启动因子2（eIF2）、eIF3、eF2、Met-tRNA、Phe-tRNA及 mRNA 的位置，因而S3a水平的变化将影响核糖体翻译功能的启动，很可能特异性地抑制某些参与生命活动的重要蛋白质的合成，影响细胞代谢[6-7]。例如，人的fte-1（v-fos transformation effector）基因早已是公认的v-fos转化效应蛋白基因，它编码的蛋白与核糖体蛋白S3a为同一产物，fte-1蛋白参与细胞转化、生长、蛋白合成及向线粒体转运蛋白，另外还有在淋巴细胞中参与信号传递的作用[1，8]。国外学者在研究核糖体蛋白S3a时发现，当v-fos基因受到抑制时，已发生转化效应的细胞可恢复正常功能，从而推断S3a蛋白在核糖体外还应具有其他功能[9]。目前认为，核糖体蛋白S3a在细胞中具有多种功能，除了参与翻译起始之外，还在调节增殖、恶性转化、细胞凋亡和细胞免疫等方面起重要作用。因此，国内外研究人员目前已对人、青鳉、家蚕、利什曼原虫等大量真核生物的核糖体蛋白S3a进行了深入的研究。GenBank中也收录了大量来源于各种真核生物的S3a基因或疑似S3a（S3a-like）基因序列。

与此相对应的是，尽管Ouarzane 等早在1998年就报道了从鸡E. tenella第1代裂殖体λZapⅡ cDNA 文库中筛选出E. tenella S3a基因，同时推测该基因编码的蛋白可能在调节蛋白合成，进而激发裂殖子、裂殖体侵袭和感染宿主细胞，适应环境变化等过程中都发挥重要作用[1]。但截止到目前，国内外既缺乏关于E. tenella S3a基因克隆和分析的报道，也没有针对E. tenella S3a蛋白生物学功能的后续研究。GenBank中也仅收录了Ouarzane 等上传的1条的E. tenella S3a基因序列[1]。本研究利用PCR技术，从鸡E. tenella江苏分离株第2代裂殖子中成功克隆出S3a基因。将本研究克隆的江苏株E. tenella S3a基因与GenBank中收录的S3a基因序列进行比对发现，本研究扩增序列有6个碱基发现突变，且其中第332、520、526位碱基突变为有义突变，引起推导氨基酸序列第111、174、176位3个位点发生突变，其余为无义突变。2条S3a基因序列同源性为97.9%，ORF碱基同源性为990%，ORF推导氨基酸同源性为98.1%。至于在不同来源的鸡E. tenella分离株中，S3a基因存在的碱基突变概率和位点的普遍性、规律性及其在生物进化和适应宿主中的意义等问题，这还需要比对大量不同来源的E. tenella S3a基因并进行更深入的研究才能得出。

通常认为鸡球虫的免疫原性主要在其无性生殖阶段（裂殖生殖），而有性生殖阶段（配子生殖）或子孢子几乎没有免疫原性。Ouarzane 等则研究发现，仅在第1代裂殖体和第2代裂殖子阶段能够检测到E. tenella S3a基因的mRNA，在孢子化和未孢子化卵囊未能检测到[1]。如果在球蟲第1代裂殖体和第2代裂殖子阶段都大量表达的S3a蛋白能够被转运到胞外发挥保护性抗原的作用，那么用S3a基因构建的球虫亚单位苗或核酸疫苗将会在抑制球虫增殖、阻断球虫侵袭和感染中发挥一定作用。再加之Cordeiro-Da-Silva等在研究中发现，硕大利什曼原虫的S3a蛋白还具有调节T细胞和B细胞活性，参与免疫调节的作用[2]。Zemzoumi等则报道了硕大利什曼原虫S3a蛋白可由胞内转运至胞外并与被膜结合，具有保护抗原的特性[3]。Barros等在研究克氏锥虫时也有类似的发现，他们一致认为是S3a蛋白由胞内转运出来与体外的被膜结合，使S3a蛋白成为了保护性抗原[10]。因此，本研究对鸡E. tenella S3a基因进行了体外扩增和分析，也可以为筛选理想的E. tenella保护性抗原、构建新型疫苗和研制抗球虫新药等打下基础。

除此之外，将本研究克隆的E. tenella S3a基因与GenBank中人和哺乳动物、植物、真菌、[JP+1]鸟类共15种生物的核糖体蛋白S3a基因进行比对发现，虽然本研究克隆和GenBank中收录的E. tenella S3a基因之间同源性最高，但是两者却与硕大利什曼原虫和布氏锥虫这2种原虫的S3a同源性较低，反而与禽鸟S3a基因的同源性较高。这可能对研究鸡E. tenella 寄生于宿主的过程中，S3a基因发挥的生物学功能和免疫学作用等有重要的启发意义，应该引起研究人员的关注。

[HS2][HT8.5H]参考文献：[HT8.SS]

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