张荣华，王 曦，李武峰

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

哺乳动物克隆技术研究进展

张荣华1，2，王 曦2，李武峰1

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032）

自首例克隆羊“多莉”诞生以来，哺乳动物克隆技术研究就广受关注，应用此技术已获得了小鼠、水牛以及家兔等动物。总结了近年来克隆过程中的关键技术和获得的研究成果，不仅更进一步了解了胚胎发育、细胞生长等生物现象，同时也为将来解决克隆中存在的问题，如成功率低、胎盘肥大、重编程异常、出生死亡率高等奠定了理论基础，开拓了新的思路。随着哺乳动物克隆技术的迅速发展，其在多个领域应用前景广阔，如利用克隆技术进行快速大规模的品种改良、有效地保护濒危动植物，并可将核移植技术应用于疾病的治疗，通过克隆生物反应器生产所需的物质，具有重要的实践意义。

哺乳动物；克隆技术；胚胎重组

希腊语“klon”就是克隆，指用小枝丫去增殖，开始于植物学[1]。动物克隆广义上讲是指动物的无性繁殖，18世纪兴起了微生物学，科学家们观察到低等动物一般通过分裂、出芽和断裂3种方式进行繁殖，这些都是“克隆”——无性繁殖[2]。目前人们研究的克隆是人为干预的无性繁殖。此技术发展至今，可用胚胎细胞或体细胞进行克隆而获得个体。具体的克隆大致可分为细胞核移植[3]和胚胎分割[4]2种。通常人们所谓的哺乳动物克隆是指前一种，并且也获得了很多克隆动物。

克隆试验的成功无论是在理论还是应用方面都具有重大意义。理论上，它打破了传统思维，即动物细胞的生长、分化是不可逆的。证实了已分化的体细胞核与受精卵相似，在适当的条件下，可以恢复其全能性，发育成为新的个体。同时，此理论为遗传学、基因表达调控等方面提供了新的思路。应用上，克隆技术可以加快优良家畜品种的繁殖。自然繁殖时，优良家畜都是经过多次杂交、基因重组产生的。此过程耗时长，成本高，工作量大，而且因基因突变导致优良性状消失的概率大。而利用体细胞克隆技术则可解决以上问题。此外，克隆技术可以用于保护濒危动物，通过构建基因库，利用克隆扩大动物的群体。在医学研究方面，利用克隆技术培育器官，避免了排异性，提高了安全性且可以保证大量供应。

本文介绍了目前克隆技术各过程的主要方法与存在的问题，并指出进一步的研究方向。

1 哺乳动物克隆研究进展

1.1 哺乳动物胚胎克隆

胚胎克隆即采用专门的方法和技术建立胚胎的无性繁殖系，以获得具遗传同质性动物（克隆动物）的过程。胚胎克隆从广义来讲，可分为胚胎分割以及细胞核移植，狭义的即胚胎细胞核移植技术。该技术是将早期胚胎细胞的细胞核或卵裂球，通过融合、激活和体外培养等方法，移植到去核卵母细胞中，构成新合子，然后移植给受体。此生物技术所获得的后代将与核供体基因型相同[5]。提出胚胎克隆的理论基础是胚胎细胞与受精卵一样，都具有发育全能性。但因为早期试验条件有限，且哺乳动物的受精过程在体内发生，所以，首次胚胎细胞核移植成功是在1952年BRIGGS等[6]研究的两栖类动物——美洲豹蛙。随后体外受精兔也获得成功，为哺乳动物胚胎细胞核移植技术奠定了基础。

1.2 哺乳动物胚胎干细胞的核移植技术

胚胎干细胞是一种可分化成多种功能型细胞的细胞类型[7]。目前，从组织中已分离出了胚胎干细胞（ES）和成体干细胞。其中，胚胎干细胞是从早期胚胎中分离出的高度未分化、具有发育全能性和多能性的一类细胞[8]。ES细胞的多能性是指它具有发育成为不止一种细胞或组织的能力。ES细胞的全能性概念是它可以在某条件下去分化，再生为机体内的各组织甚至可发育成完整个体的能力[9]。

根据以上的理论基础，动物克隆的方法之一就是胚胎干细胞核移植技术[10]。研究者们用ICM细胞为供体构成克隆胚，发育成正常仔鼠。CAMPBELL等[11]将ES细胞传至3代后进行核移植，也获得4只绵羊。另外，此方法在兔、山羊和牛等动物上都取得了进展，但此技术仍不成熟，尚待进一步研究[12]。

1.3 哺乳动物体细胞的核移植技术

体细胞核移植技术（SCNT）是将一个动物的体细胞核移植入去核的卵母细胞中，重构克隆胚，发育为与供体动物细胞基因完全相同的后代[13]。

早期人们认为，细胞的分化程度越高，其全能性越差，甚至已高度分化的体细胞则完全丧失全能性。因此，人们的研究集中在胚胎干细胞上。直到BRINSTER[14]研究发现，体细胞可脱分化抑制重新发育分化，打破了以往的观念。而体细胞的核移植研究技术是在1997年WILMUT等[15]宣布世界首例体细胞克隆绵羊“多莉”诞生，才变成焦点。应用此技术已成功获得了大鼠、兔、骡子、马、水牛、欧洲盘羊[16]和非洲野猫等动物。同时，此技术还可保护珍稀的濒临灭绝的动物，例如雪貂[17]。

SCNT技术的应用领域十分广泛，如加速繁殖优良畜种，培育转基因品种[18]，利用克隆技术治疗疾病[19]，保护濒危物种等。但总的来说效率很低。KISHIGAMI等[20]研究指出，利用SCNT技术克隆出的动物常有异常，如胎盘肥大、胎儿患呼吸疾病等问题，且克隆动物成活率仅为2%。现在许多学者正努力探究着影响体细胞克隆成功率的因素，如核供体、核受体、供受体间的相互作用及核移植操作技术等。

2 核移植的受体细胞选择与去核

2.1 核移植受体细胞的选择

克隆技术的第一步就是选择受体细胞。早期人们使用去核受精卵，但因为受精卵已被激活，重编程能力差，所以，越来越多的试验使用MⅡ期成熟卵母细胞为受体。这是因为MⅡ期的卵母细胞周期长，并且去分化的必备因子——MPF活性高，对供体细胞核的重新编程更有利[21]。

WILLADSEN[22]第1次用去核的成熟卵母细胞作受体，获得了克隆绵羊。之后CHESNÉ等[23]先将卵母细胞注射HCG，再培养16 h用作受体，囊胚率为47%，并得到了胚胎克隆兔。陈大元等[24]将卵母细胞培养大约19 h，选择第一极体刚形成的做胞质受体，囊胚率约26.63%，并获得克隆牛。

同样，MⅡ期卵母细胞做核受体前，进行激活或未激活的结果也大不相同。研究证明，在激活后的卵母细胞中，成熟促进因子浓度降低，不足以支持重构胚的发育。所以，大多采用未激活的MⅡ期卵母细胞作为核受体。

许多试验发现，体内、外成熟的卵母细胞也有差异。当卵母细胞体外培养技术成熟时，用此细胞做核受体，克隆成功率大大提高。如牛、猪、羊等的卵母细胞体外培养技术较成熟，所以，成功克隆的案例较多。但很多物种的体外培养技术还不够完善，需进一步研究。

2.2 核移植受体细胞的去核

受体细胞的去核技术对核移植至关重要，主要有以下几种去核方法。

2.2.1 盲吸去核法 此方法是除去第一次减数分裂后卵母细胞形成的纺锤体。此时纺锤体在第一极体下方，除去第一极体以及下方约1/4的胞质，以达到去核的目的。但目前只有鼠卵母细胞可以观察到纺锤体，因此，称为盲吸法[25]。此方法可以避免荧光染料和紫外照射对卵母细胞不利的影响。但后续研究发现，兔的纺锤体不一定在第一极体下方，可能位于对面，造成盲吸法的效率降低。所以，人们逐渐放弃使用盲吸法去核。

2.2.2 半卵去核法 其是先在极体上部做切口，再从切口处吸出第一极体及1/2的胞质，最后荧光染料Hoechst33342确认。但由于卵母细胞胞质减少而且荧光染料对核受体有不利影响[26]，所以，该去核法使用很少。

2.2.3 切割去核法 它是对半卵去核法的改进。具体方法：沿极体与卵母细胞相交处，将卵母细胞平分，将无极体附着的半卵作为核移植受体细胞[27]。此方法操作的基础是卵母细胞与第一极体黏着在一起，并无透明带，卵母细胞要用植物凝集素（PHA）和链霉蛋白酶预处理。此方法的优点是去核率高，甚至可达90%，没有荧光染料和紫外照射的影响[28]。最具有商业意义的是该法在体视显微镜下就可完成。

2.2.4 高速离心去核法 此方法的原理是卵母细胞的细胞核、质与极体的质量不同，不同转速可使细胞核与极体一同离心排出。具体过程：将卵母细胞用含有细胞松弛素B的培养液培养，梯度离心后取约1/3的部分作为核受体胞质。它的优点是可一次性处理大量核受体，但还未得到克隆后代，有待进一步验证。

2.2.5 化学诱导去核 该方法可一次性制备大量的卵母细胞，并对操作的技能要求较低，造成的机械性伤害小[29]。方法是先将MⅡ期卵母细胞激活，再在成熟液中添加抑制剂脱羰秋水仙碱，使其排放第二极体。此化学物质使核染色质进入第二极体，从而去核。但大量的试验表明，此方法去核率仅为54%，除了小鼠和猪外，未获得其他克隆动物。

此外，还有功能性去核法，它利用的是紫外线或激光照射使核变性，从而达到去核目的[30]；挤压法是指在卵母细胞发育的过程中，当多数的卵母细胞准备排出第一极体时，破坏透明带并挤压，使极体与尚未分离的核一同排出。

同时，为了能够精确去核，利用卵母细胞MⅡ期染色体是由纺锤体连接在赤道板上的原理[31]，通过寻找纺锤体定位染色体。所以，研究者发现了几种示核法。荧光染料法是使用荧光染料Hoechst 33342处理卵母细胞后，可通过紫外线观察到极体与卵母细胞中期板的相对位置，从而协助去核成功。但染料和紫外线都会对卵母细胞有一定的不利影响，从而妨碍胚胎发育成熟。极化显微镜法是利用构成纺锤体的蛋白有极性的特点，设计了极化显微镜，可在普通光路下观察到极体和中期板。由于它破坏性小，很多核移植试验采用此方法。

3 核移植供体细胞的选择与分离

3.1 哺乳动物核移植中供体细胞的选择

大量研究表明，不同的供体细胞类型适用于不同的物种。供体细胞大致分为胚胎分裂球、胚胎干细胞（ES）和体细胞。首例克隆成体的绵羊多莉，使用的供体细胞是乳腺上皮细胞。另外，皮肤成纤维细胞、巨噬细胞、间质细胞和一些器官细胞等体细胞都已被证实可用做核供体细胞。相同的试验条件下，成体干细胞作为供体的胚胎发育率比分化完全的体细胞高5～10倍，说明外遗传修饰作用会促使分化成各种表型细胞，影响克隆的成功率。

供体细胞的发育周期也是重要因素，不同时期，核内的DNA含量不同，使得核移植效率也大不同。WILMUT等[15]研究认为，血清饥饿法诱导细胞进入并停留在G0期，才能得到克隆羊多莉。但KUES用0.2%的血清对猪胎儿成纤维细胞饥饿处理5 d后，细胞凋亡率约为40%[32]。LAI用秋水仙素处理供体细胞，发现重组胚中排出极体的细胞大多来自G2/M期，少数来自G0/G1期。随后愈来愈多的研究者认为，G0/G1期的细胞并不是克隆成功的必备条件[33]。

有研究表明，细胞培养的传代数也影响着克隆结果。ROH等[34]发现，早期细胞（8～16代）比晚期细胞（17～32代）有利于克隆，因为培养时间越长，供体细胞内染色体的畸形率越高。而CAPECCHI则认为，长时间的传代培养可以增加细胞数量，并且减少以后发生基因修饰的机会，利于核移植[33]。后来经大量试验证实，10代左右最好，尽量少于15代。

除了以上的因素，供体细胞仍有许多因素影响着克隆效率，如动物年龄等。

3.2 核移植中供体细胞的分离

将合适的供体细胞分离成单个细胞是制备供体细胞的过程之一。胚胎未发生致密化时，去除透明带后进行吹打，即可得到分散的卵裂球。随后发现用不含Ca2+，Mg2+的培养液短时间处理供核细胞，或用胰蛋白酶消化、免疫外科、显微外科等方法也可分离供体细胞。但当胚胎细胞连接变紧密，形成桥粒，发生了致密化紧缩后，就无法用常规方法分离，增加了很大的难度。

4 核移植与激活

4.1 核移植的方法

4.1.1 细胞融合法 诱导融合最早使用的是灭活后的仙台病毒，但其毒性大，融合率不稳定。后来研究者使用毒性相对较小的聚乙烯乙二醇（PEG）融合，但融合效率低，无法推广。直到WILLADSEN[22]利用直流电诱导细胞融合，此方法效率高，更安全稳定，被广泛使用。

4.1.2 细胞注入法 此方法是第一次成功克隆哺乳动物采用的胚胎重建法。但由于对受体细胞损伤太大，进行了改良。改进后先用细玻璃针把供体细胞的细胞膜弄破，将供体核注入到受体细胞内。而且发现将供体细胞注入受体细胞内再将核吸出，更利于重建后的发育。目前，最先进的胞质内注射仪器是Piezo，可以很大程度上减小伤害[35]。

除了以上2种主要的核移植方法，利用激活抑制剂（MG132）、四倍体囊胚腔、去除透明带等方法都成功进行了核移植。

4.2 克隆胚胎的激活

激活是使克隆胚胎进一步发育的必经过程，原因是未激活的卵母细胞中成熟促进因子（MPF）浓度较高，导致它停留在MⅡ期阶段[36]。在受精过程中，精子的进入导致卵母细胞中Ca2+周期性波动，当Ca2+浓度升高时伴随MPF浓度降低。基于此，研究者们发现了2条激活思路分别为产生Ca2+波动和降低MPF的水平。

激活方法分为物理激活和化学激活。物理激活又包括机械法、温度变化刺激和电激活等。很多细胞通过机械刺激得到激活，如猪、牛等，但很少得到囊胚。温度变化激活是指用温度刺激卵母细胞，最早使用于兔的未受精卵，在10℃处理后发现其中的18%发育为囊胚[37]。需注意的是，温度激活的时间不可过长，否则会影响细胞活性。电激活是利用直流高压电脉冲，在细胞膜上造成可恢复微孔，使融合液中的Ca2+进入细胞内，升高其浓度。虽然电脉冲无法形成Ca2+浓度波动，只能瞬间性的升高，但少次的电脉冲就可激活大部分的卵母细胞[38]。电刺激的使用最为广泛，1989年，ONODERA等[39]开始对兔卵母细胞使用，一直到现在，小鼠、牛、猪等卵母细胞都成功激活。

化学激活包括乙醇、Ca2+载体和IP3等。激活不同物种的卵母细胞可以用无特异性、不同浓度的乙醇介导。它的原理是在细胞膜上形成三磷酸肌醇（IP3），促使细胞内存储的Ca2+释放，引发浓度波动[40]。Ca2+载体是一类很有效的化学激活物。使用Ca2+载体——A23187激活小鼠卵母细胞，发现在无Ca2+的培养液中激活率比含Ca2+培养液中更高，说明Ca2+载体可增强胞质内存储的Ca2+释放，且抑制蛋白质合成[41]。IP3是另一种引发Ca2+波动的物质，与受精过程更相似。但IP3只能对卵母细胞激发，对原核期胚胎无作用，所以，需要与其他物质一同激活。

由于仅使用单一方法激活并不彻底，所以，多数试验采用联合方法。PARRISH等[42]用6-DMAP方法结合电脉冲对牛卵母细胞激活，使其发生有丝分裂。MITALIPOV等[43]用IP3和6-DMAP联合方法激活兔卵母细胞，成功激活84%卵母细胞。大多数的融合-激活是先进行2次电脉冲后再使用化学试剂激活。

5 胚胎的体外培养及胚胎移植

核移植后进行科学的胚胎体外培养是提高克隆效率的重要步骤。目前的技术无法完全模拟胚胎在体内的发育环境[44]，但科学的体外培养条件也可以大大降低胚胎死亡率，提高稳定性。影响体外培养环境的因素很多，如培养环境的气体浓度，低氧气浓度可提高胚胎的发育能力。还有体外培养时间，试验发现，猪和兔培养24 h后移植受体体内最佳，而牛、羊等家畜则所需时间更长[45]。影响因素中最重要的一个是培养液的选择。目前体外培养液大约有3种，一是简单型培养液，含有基础培养液和牛血清白蛋白、胎牛血清；二是复杂培养液，在简单型培养基中添加了维生素、嘌呤、TCM199等营养成分；三是共培养液，因为适量的体细胞可除去不利影响因子，所以，在简单培养液中加部分饲养细胞，促进了胚胎发育。除了以上因素，胚胎质量、重构程序、受体供体发展阶段等都是影响体外胚胎培养的因素。

体外培养后，通过手术移植或非手术移植将胚胎植入受体动物。

6 克隆技术存在的问题

6.1 成功率低

克隆成功率仅为1%～3%的原因有很多。一是妊娠早期易流产；二是胎盘发育异常；三是怀孕周期长、体质弱导致难产、出生后死亡率高。四是表观修饰异常，导致基因重组排列，增加了胎儿发育异常或死亡[46]。

6.2 端粒酶活性问题

端粒对保护染色体至关重要，每次细胞复制，端粒核苷酸就会减少50～100 bp。而端粒的产生则需端粒酶，它决定着细胞的活性大小。SHIELS等[47]研究发现，造成克隆羊多莉寿命短的原因是它的端粒比同龄羊要短。但也有研究证明并非都如此，如克隆牛[48]。甚至克隆鼠的端粒比正常鼠的还要长，平均寿命也延长了7个月[49]。因此，研究者认为，动物的端粒酶活性应该是可控的。

另外，还存在供体与受体细胞发育周期不完全一致、线粒体来源不确定和基因印记扰乱等问题，有待于对细胞活动及相关技术深入研究。

7 克隆技术的发展前景

哺乳动物克隆不仅仅为生物学带来了新的探究领域，更为医学、畜牧业等提供了新的方法思路，应用前景十分广阔。

在生物学领域上克隆涉及学科广泛，如细胞学、胚胎发育学、分子生物学和遗传修饰学等，可加深对细胞发育、全能多能性和核质相互关系等基本问题的认识。医学家将克隆技术应用于治疗，从病人体内取体细胞，植入去核的细胞中重建，最后分化成所需的类型用于治疗，有助于人们探究肿瘤、细胞衰老等疾病。同时发现，转基因生物反应器可以用于生产所需的药物蛋白，并降低成本。还可以与生物反应器相结合，进行基因修饰后，利用膀胱、乳腺等动物器官生产所需的蛋白，提高转基因技术的效能。在畜牧业方面，克隆技术可以快速的选育优良品种，并且大量扩增遗传性状优良的动物。克隆技术亦可促进濒危物种的扩繁和保存，减少科学研究中所需试验动物的数量，如欧洲盘羊。

8 结语

在哺乳动物克隆过程中，选择科学合理的技术可以大大的提高成功率。但有些克隆步骤仍不够完善，克隆结果存在一定的缺陷，如胎盘肥大、基因异常、生产率低等。随着克隆技术的进一步发展，它的过程与机制会彻底清晰，更好的提高应用价值。

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Research Progress of Mammalian Cloning Technology

ZHANGRonghua1，2，WANGXi2，LIWufeng1

（1.College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China；2.Institute ofAnimalHusbandry and Veterinary，ShanxiAcademy ofAgriculturalSciences，Taiyuan 030032，China）

Since the birth ofthe firstcloned sheep"Dolly",mammalian cloning technology has attracted much attention.Using this technology,mouse,buffalo,rabbits and other animals had been obtained.In this paper,the key techniques and achievements ofcloning in recent years were summarized,which was not only to further understand the embryonic development,cell growth and other biological phenomena,for the future to solve the problems in cloning,such as low success rate,placentalhypertrophy,reprogramming abnormalities, high mortality and lay the theoreticalbasis,opened up new ideas.And with the rapid developmentof mammalian cloning technology,it had a good prospectin many fields.Such as the use ofcloning technology for rapid and large-scale varieties ofimproved,optimized and effective protection of endangered plants and animals,and nuclear transplantation technology for the treatment of diseases,cloning bioreactorproduction ofthe required material,has a very significantpracticalsignificance.

mammals;cloning techniques;embryo recombination

S811.4

：A

：1002-2481（2017）09-1577-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.42

2017-04-21

山西省农业科学院科技自主创新能力提升工程项目（2017zzcx-02）

张荣华（1992-），女，山西太原人，在读硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。李武峰为通信作者。