石燕碧，武文君，梁晖辉，乔玉琪，武文奇，牛颜冰

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

三七愈伤组织对滇重楼种子萌发的影响

石燕碧，武文君，梁晖辉，乔玉琪，武文奇，牛颜冰

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

滇重楼为延龄草科重楼属多年生草本植物，具有抗癌、止血等功效，市场应用前景广阔，但其种子在实际生产中存在萌发周期长和萌发率低等缺点。为了缩短滇重楼种子萌发时间，提高其萌发率，在三七愈伤组织上对滇重楼种子进行暗培养和光照培养试验。结果表明，在三七愈伤组织上进行暗培养能明显缩短滇重楼种子的萌发时间，最快在第10天就开始萌发，萌发高峰期在第20～30天，平均萌发率为12.5%。

滇重楼；三七愈伤组织；种子萌发

滇重楼（Paris ployphylla Smith var.yunnanensis）又名云南滇重楼，以根茎入药[1]，是云南白药的主要原料，也是宫血宁、夺命丹、总皂苷片、季德胜蛇药片、热毒清等65个重要中成药的主要组方原料[2]，具有抗癌、止血、镇痛、镇静等功效[3]。然而，滇重楼种子有“2次休眠”的生理特征，在自然状态下其发芽率很低，且不整齐[4]，需要经过2次发育[5]，即需经过2冬1夏才能萌发，生产周期比较长，远不能满足快速增长的市场需求。同时，经多年来的乱采滥挖，滇重楼野生资源已日趋枯竭，依靠野生滇重楼已远远不能满足医药行业的需要，急需向人工栽培模式发展，但如何缩短滇重楼种子的萌发时间、提高萌发率是滇重楼人工繁育过程中亟待解决的难题。

本试验采用培养皿进行看护培养的方式，研究三七愈伤组织对滇重楼种子萌发的影响，以期为滇重楼种子快速繁育和人工栽培提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

三七愈伤组织，在山西农业大学生命科学学院组织培养实验室进行培养，生长约15 d即可使用；滇重楼种子，购于河北安国中药材市场。

1.2 试验方法

1.2.1 种子前处理 将滇重楼种子放在温水里浸泡12 h后反复搓洗去掉红皮，弃去上浮的种子，捞取沉在下面的种子，晒干冷藏于冰箱中，备用。

1.2.2 培养基的配制 按照配方MS＋0.5 mg/L NAA＋0.5 mg/L 6-BA＋3%蔗糖＋0.8%琼脂粉，进行三七愈伤组织诱导培养基配制，pH值为5.6～5.8，经高压蒸汽灭菌后，倒于培养皿待用。

1.2.3 种子消毒处理 试验种子先经75%乙醇浸泡1 min后，用超纯水冲洗2～3次，接着用20%的次氯酸钠浸泡15 min，再用超纯水冲洗5～6次，最后取出放于无菌滤纸上吸干种皮表面的水分，待接种。

1.2.4 接种处理 在超净台内挑取小块三七愈伤组织（让其在培养基上有个生长的空间）于培养基上，每个培养皿中均匀放置5小块，然后在每块三七愈伤组织上放大小约1 cm2且经过高压灭菌的滤纸，然后在每片滤纸上接种2～4粒种子，封口。暗培养编号为1～6，光照培养编号为Ⅰ～Ⅵ，同时以无三七愈伤组织培养（种子直接接种在培养基上）为空白对照组。所有试验种子放在温度为（19± 2）℃的培养架上，分别进行暗培养和光照培养。

1.2.5 生根培养 为了进一步观察滇重楼生根、生长情况，将培养皿中萌发的滇重楼种子移接在生根培养基中（MS＋1 mg/L IBA＋3%蔗糖＋0.8%琼脂粉，pH值为5.6～5.8），生长温度为（19±2）℃。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 萌发率 种子萌发开始以露出胚芽为起点。萌发率是种子萌发能力最直接的反映，但是并不能全面反映种子的萌发能力，因为它只能反映种子萌发数量的多少，而不能反映种子萌发速率的快慢。

1.3.2 萌发速率指数（GR） 萌发速率指数反映种子萌发速率的快慢，与种子萌发率和萌发时间长短有关，在萌发速率快、萌发历期短时，其值较大[6]。

其中，Ti为第i天，Gi为第i天的萌发率[7]。

1.3.3 萌发指数（GI）

其中，Gi为逐日发芽粒数，Di为Gi对应的发芽时间[8]。

2 结果与分析

2.1 光照培养和暗培养对滇重楼种子萌发的影响

由表1可知，暗培养滇重楼种子比光照培养效果好，其中，暗培养在第10天就开始萌发（图1-a）；在第25～30天时为种子萌发高峰期；第35天生长情况良好（图1-b）；之后由于三七愈伤组织逐渐褐化，导致40 d以后种子不再萌发。光照培养滇重楼种子，最早在第30 d才开始萌发。总体来看，光照培养的萌发结果晚于暗培养。

表1 不同培养条件下滇重楼种子在不同时间段的萌发个数

由表2可知，在三七愈伤组织上进行暗培养滇重楼种子的萌发数要多于光照培养，并且萌发速度要快于光照培养，暗培养平均萌发率为12.5%，平均萌发速率指数为0.014 8；而光照培养的平均萌发率为2.6%，平均萌发速率指数为0.001 1。暗培养的各项萌发指标都高于光照培养，说明暗培养更有利于促进重楼种子的萌发。

表2 滇重楼种子各项萌发指标

2.2 滇重楼生根结果

滇重楼种子的胚根长约1 cm（图1-b）时，培养瓶中三七愈伤组织已经占据很大空间，为了让滇重楼更好地生长，将其移接到生根培养基中，大约培养60 d就生根，并可长出真叶（图1-c）；培养至180 d时，滇重楼生长良好，且根变长增粗，同时根的周围长出少许愈伤组织（图1-d）。

3 讨论与结论

关于愈伤组织的研究很多，王淑莉等[9]对沙芥叶片愈伤组织诱导进行了研究；李明军[10]对怀山药茎段愈伤组织的诱导进行了研究。但未分化的愈伤组织有很强的分裂能力，有很强的活力[11]。种子萌发的基本三要素为光照、水分和温度，而滇重楼种子属忌光性、低温型种子[12-13]。因此，本试验在（19± 2）℃的温度下进行暗培养。三七愈伤组织取材广泛，在山西农业大学组培实验室中有较多的三七苗，因此，试验在三七愈伤组织上进行看护培养。根据研究目的选用不同的外植体，一般情况下选用茎作为外植体会取得不错的效果[14]。本试验设置了光照培养，是因为生长活跃的愈伤组织才能对种子起作用，光照则可以促进三七愈伤组织的生长，所以设置光照培养来相互对照。试验结果表明，暗培养优于光照培养，暗培养平均萌发速率指数为0.014 8，光照培养平均萌发速率指数为0.001 1。从萌发速率指数来看，在三七愈伤组织上进行暗培养滇重楼种子的萌发数要多于光照培养，萌发时间较光照培养短。

现阶段滇重楼的种植方式主要是根茎繁殖和种子直播。其中，根茎繁殖需占用大量原材料，种子直播发芽率低，但从长远来看，用种子直播繁殖实生苗是一种经济实用的方法。因此，采用适宜的方法对滇重楼种子进行处理、提供大量优质的种苗，是滇重楼人工种植过程中较为重要的环节。关于促进滇重楼种子的萌发试验多采用化学、物理、层积的方法，本试验用三七愈伤组织培养来促进滇重楼种子的萌发，可以明显加快滇重楼种子的萌发速度，最快在第10天就开始萌发，萌发高峰期在第20～30天，提前解除滇重楼种子的休眠期，提高了种子的利用率。但平均萌发率仅为12.5%，分析其原因可能有2个，第一，在培养过程中发现三七愈伤组织褐化较快，导致滇重楼种子在三七愈伤组织上培养的有效时间缩短，使萌发率降低，所以寻找更合适的愈伤组织或更好地培养三七愈伤组织还需进一步研究；第二，在去种皮过程中发现，上浮的种子中不乏有大而色深的种子，实为空壳，下沉的种子多数为小而色灰的种子，少数为饱满色深的种子，而试验中萌发的种子是饱满色深的种子，所以，种质也是造成萌发率低的原因。

总体来看，在三七愈伤组织上进行暗培养滇重楼种子，可以明显加快滇重楼种子的萌发速度，提前解除滇重楼种子的休眠期。有研究表明，在整个萌发过程中，滇重楼种子内源激素GA显著升高；在滇重楼种子育苗过程中，内源激素ABA和GA起着重要的作用[15]。也有研究表明，看护培养是组织培养中比较有效的方法之一，其可能原因是因为看护细胞向原生质体提供了可促进生长的物质，或提供了一种适宜的密度效应，或吸收原生质体培养过程中产生的有毒物质[16]。本试验中三七愈伤组织影响滇重楼种子的机制可能是由于释放一种物质，并且该物质可能具有挥发性；关于本试验在三七愈伤组织上看护培养滇重楼种子的萌发机制，还有待进一步研究。

［1］国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

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Effects of Callus from Panax notoginseng on Seed Germination of Paris ployphylla Smith var.yunnanensis

SHIYanbi，WUWenjun，LIANGHuihui，QIAOYuqi，WUWenqi，NIUYanbing
（College ofLife Science，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu 030801，China）

Trillium family of Paris polyphylla Smith var.yunnanensis is a perennialherb,with cancer，bleeding and other effects, and broad market prospect,but exists in the actual production of seed germination cycle long and germination rate low.To shorten the seed germination time and increase the germination rate,this experimentcultures the seed of Paris ployphylla Smith var.yunnanensis on callus from Panax notoginseng in lightcircumstance and dark circumstance.The experiment results indicate that the dark culture can significantly shorten the germination time ofthe seed in the callus from Panax notoginseng,the fastestin tenth days to startgermination, germination peak between 20-30 days,the average germination rate was 12.5%.

Paris ployphylla Smith var.yunnanensis;callus from Panax notoginseng;seed germination

R282.71

：A

：1002-2481（2017）09-1438-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.09.11

2017-03-31

山西省普通高等学校大学创新创业训练项目（2015109）

石燕碧（1993-），男，山西晋中人，在读本科，研究方向：中药资源与开发。牛颜冰为通信作者。