武雪亮，王立坤，薛 军*，杨东东，屈 明，郭 飞，杨瑞敏，刘 博

·论著·

下调DNA结合分化抑制蛋白1基因对人结肠癌SW480细胞株体外转移和侵袭能力的影响研究

武雪亮1，王立坤2，薛 军1*，杨东东3，屈 明1，郭 飞1，杨瑞敏2，刘 博4

背景 既往研究已经证实DNA结合分化抑制蛋白1(Id-1)表达升高在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用，但Id-1对结肠癌细胞侵袭行为影响及机制的研究较少。目的 探讨下调Id-1基因对人结肠癌SW480细胞株增殖、转移、侵袭能力的影响及作用机制。方法 2016年1—6月，人结肠癌SW480细胞株分为3组：空白组，未进行转染；空载体组，用空载体进行转染；抑制组，采用Id-1特异小干扰RNA(siRNA)进行转染，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blotting法检测各组细胞Id-1和Ki-67基因及蛋白的表达情况，采用MTT法检测细胞增殖能力，采用细胞划痕实验、Transwell小室和Matrigel侵袭实验评价Id-1对细胞转移和侵袭能力的影响。结果 3组细胞Id-1、Ki-67 mRNA及其相应蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；抑制组细胞Id-1、Ki-67 mRNA及其相应蛋白表达水平较空白组、空载体组降低(P<0.05)。培养第1、2 天，3组细胞增殖吸光度(OD值)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。培养第3～7天，3组细胞增殖OD值比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中抑制组细胞增殖OD值较空白组及空载体组降低(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示，抑制组细胞缓慢向中央迁移，缺损处修复较缓慢，空白组和空载体组细胞向划痕处的迁移速度明显加快，而空白组与空载体组间的迁移速度差异不明显。Transwell小室和Matrigel侵袭实验表明，3组迁移细胞数量和侵袭细胞数量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；抑制组迁移细胞数量和侵袭细胞数量较空白组、空载体组减少(P<0.05)。结论 下调Id-1基因能抑制人结肠癌SW480细胞株的增殖、转移和侵袭能力，其机制可能与抑制Ki-67的表达有关。

结肠肿瘤；分化抑制蛋白1；肿瘤转移；肿瘤浸润

武雪亮，王立坤，薛军，等.下调DNA结合分化抑制蛋白1基因对人结肠癌SW480细胞株体外转移和侵袭能力的影响研究[J].中国全科医学，2017，20(8)：953-958.[www.chinagp.net]

WU X L，WANG L K，XUE J,et al.Deregulated Id-1 expression on the metastasis and invasion of human colon carcinoma SW480 cells in vitro[J].Chinese General Practice，2017，20(8)：953-958.

最新流行病学调查显示，中国男、女结直肠癌发病率分别为16.9/10万和11.6/10万，病死率分别为9.0/10万和6.1/10万，5年生存率仅为32%，低于美国和欧洲水平(64%和41%)[1-2]，且随着我国经济卫生的发展，未来结直肠癌的负担形势不容乐观。因而，亟待进行与结直肠癌相关的基础研究，为临床诊断、治疗及预后监测提供科学指导。DNA结合分化抑制蛋白1(inhibitors of DNA binding-1，Id-1)是近年来研究较热的致癌基因，能促进细胞增殖，诱导肿瘤血管内皮生成，促进肿瘤的生长及侵袭，其表达与肺癌、胃癌、胰腺癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关[3-6]。Ki-67是细胞增殖特异较高的抗原，主要用于反映细胞增殖活性，其在G1晚期、S、G2和M期的增殖细胞中表达，但在静止细胞中几乎不表达。研究显示Ki-67增殖指数高低与多数肿瘤的分化程度、恶性指数、浸润转移及预后密切相关[7]。既往研究已证实，Id-1过表达与结直肠癌的发生、发展密切相关[8]，但其具体作用机制国内外尚未见详细报道。本研究将Id-1干扰序列导入人结肠癌SW480细胞株，检测该基因干预前后Ki-67的表达及细胞增殖、转移、侵袭能力的变化，并初步探讨其致癌机制。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂 人结肠癌SW480细胞株由河北北方学院科研中心保存，RPMI-1640培养基购于美国Invitrogen公司，Id-1单克隆一抗购于Merck Millipore公

本研究背景及创新点：

DNA结合分化抑制蛋白1(Id-1)系螺旋-环-螺旋转录因子家族重要成员之一，具备广泛的生物学功能，能够抑制细胞分化、促进细胞增殖，适当条件下可抑制细胞凋亡，是细胞周期调控肿瘤血管发生的关键分子，其通过加快细胞周期、促进血管、淋巴管的生成，在肿瘤的发生、发展过程中扮演着重要角色。既往研究从基因、蛋白水平已证实Id-1表达升高在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用，且其表达与人基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-2、血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度、微淋巴管密度具有明显相关性。本研究进一步将Id-1干扰序列转染至人结肠癌SW480细胞株中，并以空白组和空载体组作为对照，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blotting法检测各组细胞Id-1和Ki-67基因及蛋白的表达情况，并采用MTT法检测细胞增殖能力，采用细胞划痕实验、Transwell小室和Matrigel侵袭实验评价Id-1对细胞转移和侵袭能力的影响，以证实Id-1能促进人结肠癌SW480细胞株的转移和侵袭能力，且该机制可能与诱导Ki-67的表达有关。

司，Ki-67单克隆一抗和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆一抗购于Santa Cruz Biotechnology公司，总RNA提取试剂和RIPA裂解液购于北京索莱宝科技有限公司，Id-1特异小干扰RNA(siRNA)及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成，反转录试剂盒和十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳标准指示剂购于Fermentas公司，聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购于Promga公司，ECL化学发光液购于Pierce公司，Transwell小室购于Coster公司，Matrigel胶购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 2016年1—6月，人结肠癌SW480细胞株用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 分组 转染前1 d，取2.5×105个细胞/孔，接种于6孔培养板，分为3组：(1)空白组，未进行转染；(2)空载体组，用空载体进行转染；(3)抑制组，采用Id-1特异siRNA进行转染，转染实验参照Lipofectamine 2000产品说明书进行操作。

1.2.3 反转录PCR (RT-PCR)法检测细胞Id-1和Ki-67基因的表达 提取各组细胞总RNA。Id-1上游引物：5′-CTGAGGCACTGGCGAGGAGA-3′，下游引物：5′-GAGAAGCACCAAACGTGACCAT-3′；Ki-67上游引物：5′-GGGTTACCTGGTCTTAGTT-3′，下游引物：5′-ATGGTTGAGGCTGTTCC-3′；GAPDH(内参)上游引物：5′-ACCCACTCCTCCACCTTGA-3′，下游引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′。反应体系：PCR Buffer，cDNA模板200 ng，dNTP 0.2 mmol/L，Taq酶1.25 μl，RNA 酶抑制剂1 μl，随机引物浓度0.4 mmol/L，共25 μl。95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，64 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；最终72 ℃延伸7 min。PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶，电泳，于紫外线灯下观察结果，以Id-1/GAPDH、Ki-67/GAPDH来定量。实验重复5次。

1.2.4 Western blotting法检测细胞Id-1和Ki-67的表达 取50 μg蛋白，置入5×缓冲液(4∶1)，100 ℃水浴，SDS-PAGE电泳，后转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加5%脱脂奶粉，弃封闭液滴加特异性的一抗-4 ℃孵育过夜，加TBST洗涤液，10 min，3次，滴加特异性二抗37 ℃孵育，再次加入TBST洗涤液冲洗，以Id-1/GAPDH、Ki-67/GAPDH来定量。实验重复5次。

1.2.5 MTT法检测各组细胞增殖情况 取对数生长期细胞，常规消化，接种于96孔培养板中，1×104个细胞/孔，设复孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。每天随机选择3组细胞的3个复孔进行检测，每孔加入MTT 20 μl，培养4 h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡结晶。在酶联免疫吸附实验(ELLSA)检测仪上检测各孔492 nm时吸光度(OD值)，连续检测7 d，绘制人结肠癌SW480细胞株生长曲线。实验重复5次。

1.2.6 细胞划痕实验 3组细胞以5×105个细胞/ml浓度接种于6孔培养板中，各组设2个复孔，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，待全部汇合，用200 μl移液器头在各孔单层细胞呈“一”字划痕，模拟培养细胞伤口模型，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，置于培养基中再次培养24 h，密切观察图像。实验重复5次。

1.2.7 细胞迁移和侵袭能力测定 取对数生长期细胞，常规消化，置于无胎牛血清的RPMI-1640培养基，配制细胞悬液。于Transwell小室的上室加入各组细胞悬液200 μl。下室加入培养基600 μl，培养24 h。取出Transwell小室，PBS清洗2遍，苏木素-伊红(HE)染色，计数穿膜细胞作为迁移细胞数量。将Matrigel胶轻轻置于Transwell小室的聚碳酸酯膜上层，同法观察穿Matrigel胶细胞数目作为侵袭细胞数量。实验重复5次。

2 结果

2.1 Id-1、Ki-67 mRNA表达水平 3组细胞Id-1、Ki-67 mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；抑制组细胞Id-1、Ki-67 mRNA表达水平较空白组、空载体组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1、图1)。

表1 3组细胞Id-1、Ki-67 mRNA表达水平比较

注：Id-1= DNA结合分化抑制蛋白1；与空白组比较，aP<0.05；与空载体组比较，bP<0.05

2.2 Id-1、Ki-67表达水平 3组细胞Id-1、Ki-67表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；抑制组细胞Id-1、Ki-67表达水平较空白组、空载体组降低，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2、图2)。

2.3 MTT法检测细胞增殖能力结果 培养第1、2 天，3组细胞增殖OD值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；3组细胞生长曲线基本重叠。培养第3～7天，3组细胞增殖OD值比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中抑制组细胞增殖OD值较空白组及空载体组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；培养第3天起抑制组细胞增殖开始减弱，第4天以后，抑制组细胞生长出现相对明显的抑制，空白组与空载体组细胞生长曲线基本接近，其增殖能力无差异(见表3、图3)。

表2 3组细胞Id-1、Ki-67表达水平比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与空载体组比较，bP<0.05

2.4 细胞划痕实验结果 抑制组细胞缓慢向中央迁移，缺损处修复较缓慢，空白组和空载体组细胞向划痕处的迁移速度明显加快，而空白组与空载体组间的迁移速度差异不明显(见图4)。

2.5 细胞转移和侵袭能力测定结果 Transwell小室和Matrigel侵袭实验表明，3组迁移细胞数量和侵袭细胞数量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；抑制组迁移细胞数量和侵袭细胞数量较空白组、空载体组减少，差异均有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表4 3组迁移细胞数量和侵袭细胞数量比较个，n=5)

注：与空白组比较，aP<0.05；与空载体组比较，bP<0.05

注：Id-1=DNA结合分化抑制蛋白1，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶

图2 Western blotting法检测3组细胞Id-1和Ki-67的表达

注：OD值=吸光度

表3 3组不同培养时间细胞增殖OD值比较

注：与空白组比较，aP<0.05；与空载体组比较，bP<0.05

图4 3组细胞划痕实验结果

3 讨论

Id-1是螺旋-环-螺旋转录因子家族的重要成员之一，表达于增殖活跃的细胞表面。Id-1通过特异性结合螺旋-环-螺旋转录因子从而抑制其与靶DNA结合及反式激活相应目标基因来调节细胞增殖分化[9-10]。早期研究发现，Id-1的功能主要体现在对肌肉细胞分化的调控中，而近年来发现Id-1在20多种肿瘤细胞中的过表达，使其在多种细胞组织中具有致瘤作用的结论得以证实[11]。在前列腺癌细胞中发现，Id-1的过表达通过诱导p16、Rb抑癌基因失活，促进血清非依赖型细胞生长[12]；在骨肉瘤中发现，Id-1通过激活Raf-1的MAPK途径导致细胞生长和促进细胞增殖[13]。而且，在胃癌、胰腺癌细胞中均发现Id-1下游靶点——核因子κB(NF-κB)通路激活，证实Id-1具有较强的致癌作用[14]。

本课题前期研究已证实，Id-1在结直肠癌组织中能通过上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，诱导血管内皮细胞增殖，促进微血管形成，为肿瘤的浸润转移提供必要的物质基础[15]。Ki-67作为一种特异性极高的肿瘤增殖性相关蛋白，广泛应用于各类恶性肿瘤浸润、转移、预后的监测。

本研究结果显示，转染Id-1特异siRNA的人结肠癌SW480细胞株中的Id-1 mRNA、Ki-67 mRNA和相应蛋白的表达水平低于未转染的人结肠癌SW480细胞株，提示抑制Id-1的表达可以抑制结肠癌细胞Ki-67的表达，从而抑制细胞的增殖、转移和侵袭。郭云[16]、叶英海等[17]对直肠癌细胞行免疫组化分析显示：Id-1能上调Ki-67和VEGF的表达，在促进直肠癌细胞增殖和转移方面三者具有协同作用。本研究进一步采用MTT法检测结果表明，抑制组细胞增殖能力明显减弱。采用细胞划痕实验测定细胞的迁移特性，Transwell小室的穿膜细胞数评估细胞的转移能力，细胞穿Matrigel胶数量反映细胞的侵袭能力。实验结果表明，Id-1特异siRNA转染的人结肠癌SW480细胞株转移、侵袭能能力显著低于未转染的人结肠癌SW480细胞株。

有研究将PD98059导入转移的乳腺癌细胞中抑制Id-1的表达，发现Ki-67、VEGF表达水平均随之下降，细胞的侵袭能力亦明显降低[18]；此外，在前列腺癌细胞系的研究中也发现Id-1能调节Ki-67、VEGF、人基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达[19]，考虑上调的Id-1通过激活Ki-67促进细胞增殖，同时通过诱导VEGF的转录，上调VEGF的表达，并激活MMP-9的分泌，从而促进肿瘤微血管生成和转移，但具体机制还需进一步探讨。

综上所述，下调Id-1能够抑制人结肠癌SW480细胞株的迁移、侵袭能力，考虑其机制是通过下调Ki-67的表达，抑制其增殖，最终抑制结肠癌细胞的转移、侵袭能力，但Id-1是通过何种通路诱导Ki-67的表达及具体机制仍不清楚，这一点也将是今后的主要研究方向。

志谢：河北北方学院科研中心、河北北方学院附属第一医院病理科全体老师给予技术、设备上的大力支持！

作者贡献：武雪亮进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，撰写论文；王立坤、郭飞、刘博进行数据收集；王立坤进行数据整理，统计学处理；杨东东进行结果的分析与解释；薛军、杨瑞敏进行论文的修订；薛军、屈明负责文章的质量控制及审校；武雪亮、薛军对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Deregulated Id-1 Expression on the Metastasis and Invasion of Human Colon Carcinoma SW480 Cells in Vitro

WUXue-liang1，WANGLi-kun2，XUEJun1*，YANGDong-dong1，QUMing1，GUOFei1，YANGRui-min2，LIUBo4

1.DepartmentofVascular&GlandSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China2.DepartmentofUltrasonography，theFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China3.DepartmentofGastrointestinalSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China4.DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China

*Correspondingauthor:XUEJun，Chiefphysician，Mastertutor；E-mail:xuejun@163.com

Background Up-regulation of Id-1 expression playing an important role in the occurrence and development of colorectal cancer has been proved by some previous studies，but down-regulation of it on the invasion of colorectal cancer cells and corresponding mechanism of action are less studied.Objective To explore the effect of deregulated Id-1 expression on the proliferation，metastasis and invasion of human colon carcinoma SW480 cells and investigate its mechanisms of action.Methods This study was conducted from January to June in 2016.SW480 cells with Id1-specific siRNA transfection，no transfection，and blank load transfection were selected as the inhibition group，blank group and blank load transfection group，respectively.Expressions of Id-1 mRNA，Ki-67 mRNA，Id-1 and Ki-67 in these 3 groups were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blotting.Cell proliferation in vitro was assessed by MTT assay.Effect of Id-1 on SW480 cells was observed by wound healing assay，Transwell migration assay，and Matrigel invasion assay.Results There were significant differences in the expressions of Id-1 mRNA，Ki-67 mRNA，Id-1 and Ki-67 among three groups(P<0.05).The expressions of Id-1 mRNA，Ki-67 mRNA，Id-1 and Ki-67 in the inhibition group were lower than those in the blank group and blank load transfection group(P<0.05).The growth curves of SW480 cells showed that，on the 1st and 2nd days of culture，the differences in the OD value indicating the SW480 cells proliferation ability among three groups were not significant (P>0.05)，but on the 3rd to the 7th days of culture，the differences in the OD value indicating the SW480 cells proliferation ability among three groups were significant (P<0.05)，and OD value indicating the SW480 cells proliferation ability in the inhibition group was significantly weaker than that in the blank group and the blank load transfection group (P<0.05).The results of wound healing assay showed that SW480 cells in the inhibition group migrated to the scratched area and closed the wound slowly，while those in the blank group and blank load transfection group did so more quickly，but the difference between the latter two groups was not distinct.Results of Transwell migration assay and Matrigel invasion assay demonstrated that the number of migrating and invading SW480 cells differed significantly among three groups(P<0.05);the inhibition group had less the number of migrating and invading SW480 cells than the other two groups(P<0.05).Conclusion Deregulated Id-1 has significant inhibition effect on the proliferation，metastasis and invasion of human colon carcinoma SW480 cells.The mechanism of action might be related with the reduced effect of Ki-67.

Colonic neoplasms；Inhibitor of differentiation protein 1；Neoplasm metastasis；Neoplasm invasiveness

河北省科技支撑计划资助项目(152777237)；河北省卫计委医学科学研究重点课题计划(20150058)；河北省张家口市科技局指令性计划(1311055D)

R 735.35

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.08.013

2016-12-08；

2017-01-10)

1.075000河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院血管腺体外科

2.075000河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院超声科

3.075000河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院胃肠外科

4.075000河北省张家口市，河北北方学院附属第一医院病理科

*通信作者：薛军，主任医师，硕士生导师；E-mail:xuejun@163.com