刘亚樵, 韩学军, 谭好臣, 陆洪省

(山东科技大学 化学与环境工程学院，山东 青岛 266590)

一株高效氨氮降解菌的分离及其氨氮去除能力分析

刘亚樵, 韩学军, 谭好臣, 陆洪省

(山东科技大学 化学与环境工程学院，山东 青岛 266590)

筛选和鉴定高效降解氨氮的细菌，并应用到污水脱氮处理中。首先从活性污泥中分离筛选出12株氨氮降解菌，选取其中氨氮降解能力最强的菌株(命名为AN-1)为研究对象，对该菌株形态、生理生化性质、系统分类学位置、不同影响条件下的氨氮降解能力进行分析。结果表明：菌株AN-1为革兰氏阴性菌，杆状，菌落为乳白色，接触酶和氧化酶反应均为阳性。菌株AN-1降解氨氮的最适宜温度为30 ℃，pH为8.0，氨氮降解率最高达78%；该菌株16S rDNA序列与Shinellazoogloeoides(GU930756)相似度最高(95%)。因此，该氨氮降解菌AN-1具有高效降解氨氮的能力，属于申氏杆菌属(Shinella)。

氨氮降解菌；申氏杆菌；活性污泥；分离

对氨化细菌分离筛选的研究[2-8]很多，目前已知的氨化细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、 粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷菌属(Serratia) 及微球菌属(Micrococcus)[9-10]。本研究是从山东某污水厂活性污泥中筛选、分离氨氮降解菌，对其形态、生理生化性质、氨氮降解能力以及分类学位置进行了分析，为污(废)水中高效氨化细菌的分离筛选以及水体富营养化控制提供一定的理论基础。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

分离氨氮降解菌的活性污泥来自于山东某污水处理厂。

使用的化学试剂: 硫酸铵、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸氢钠、对氨基苯磺酸、α-奈胺，均为分析纯。

纳氏试剂的配制：称取60 g氢氧化钾，溶于约250 mL无氨水中，冷却至室温。另外称取20 g碘化钾溶于100 mL无氨水中，边搅拌边逐步加入二氯化汞结晶粉末(约10 g)，至出现朱红色沉淀不易溶解时，改为滴加饱和二氯化汞溶液，保持搅拌，到出现少量朱红色沉淀不易溶解时，停止滴加饱和二氯化汞溶液。然后把该溶液缓慢注入上述已冷却的氢氧化钾溶液中，边注入边充分搅拌，并用无氨水稀释至400 mL，然后静置过夜。最后将该溶液的上清液转移至聚乙烯塑料瓶中，常温避光保存。

格里斯试剂配制：对氨基苯磺酸0.5 g，溶入150 mL 10%醋酸溶液中，得到溶液I；称取α-萘胺0.1 g，加入50 mL去离子水中，煮沸，再缓缓加入150 mL 10%醋酸溶液，得到溶液II。溶液I和溶液II分别保存在棕色瓶中，待用。

1.2 培养基组成

氨氮降解菌富集培养基[11]组成：(NH4)2SO4，2 g/L；NaCl，0.3 g/L；FeSO4·7H2O，0.03 g/L；K2HPO4，1 g/L ； MgSO4·7H2O，0.03 g/L；NaHCO3，1.6 g/L；H2O，1 L；pH，7.2。121℃灭菌20 min。固体培养基配制时加入琼脂粉(15 g/L)，半固体培养基配制时加入琼脂粉(3 g/L)。

1.3 实验方法

1.3.1 氨氮测定

氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法(国标法，HJ 535—2009)。测定步骤：首先配制一系列浓度的铵标准使用液各50 mL，再分别加入1.0 mL酒石酸钾钠溶液和1.5 mL的纳氏试剂，在425 nm处测定吸光度，并绘制标准曲线。吸取适量水样，定容到50 mL，分别加入酒石酸钾钠溶液(1.0 mL)和纳氏试剂(1.5 mL)，在425 nm处测定吸光度，根据标准曲线，计算出水样中氨氮浓度。

1.3.2 氨氮降解菌富集及分离

取10 mL活性污泥加入到盛有200 mL富集培养基的三角瓶中，30℃条件下振荡(160 r/min)培养，每隔1 d取培养液，用格里斯试剂检验亚硝酸盐的生成情况，根据红色深浅判断氨氮降解菌的繁殖情况。培养7 d后取10 mL富集培养液转接到新鲜的200 mL富集培养基中，重复上述操作3次。

取富集3次后的培养液0.03 mL划线培养到固体平板培养基上，30℃条件下静置培养7 d, 分别取其中的单菌落重复划线培养3次，将纯化得到的12个单菌落分别保存到半固体氨氮降解菌富集培养基中，待用。

1.3.3 高效氨氮降解菌的筛选及其生理生化、生长曲线测定

对上述纯化得到的12个单菌落分别用富集液体培养基进行培养，每隔1 d取培养液用格里斯试剂检验，根据颜色深浅比较不同菌株的氨氮降解能力，选取颜色变化最深的菌株并将该菌株命名为AN-1，菌株AN-1即为氨氮降解能力最强的菌。然后对菌株AN-1的生理生化性质进行测定，包括革兰氏染色、接触酶、氧化酶、V.P实验、硝酸盐、亚硝酸盐利用等进行测定，操作方法见文献[12]。

生长曲线测定：用液体富集培养基对菌株AN-1进行培养，培养基pH为7，培养温度为30℃，振荡培养(160 r/min)，每隔1 d 测定培养液吸光度(OD560)，作出时间～吸光度曲线。

1.3.4 不同条件对氨氮降解能力的影响测定

1) 不同pH条件对氨氮降解能力的影响

将菌株AN-1接种到液体富集培养基中培养3 d， 分别取富集培养液5 mL接种到 pH分别为6.0、7.0、8.0和9.0的195 mL富集培养基中，30℃条件下振荡培养(160 r/min)， 培养5 d后测定培养液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

2) 不同温度条件对氨氮降解能力的影响

取1.3.4(1)中富集培养液5 mL接种到195 mL富集培养基中，分别在10、20、30和40℃条件下振荡(160 r/min)培养5 d，测定培养液中剩余氨氮含量，求出氨氮降解率。

1.3.5 菌株AN-1的系统分类位置确定

1) DNA提取

菌株AN-1 DNA的提取采用柱式基因组抽提试剂盒(生工生物工程公司(上海)股份有限公司UNIQ-10)，提取方法按试剂盒说明书。

2) PCR对菌株16S rDNA 的扩增

PCR扩增引物采用细菌16S rDNA通用引物[13]，引物序列：

正向引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；

反向引物1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。

3) PCR反应体系以及反应条件

PCR反应体系(25 μL)：2.5 μL 5×Buffer(含Mg2+)，0.5 μL模板DNA，各0.5μL 7F(10 uM)和1540R(10 uM)，1μL dNTP(各2.5 mM)，超纯水定容至25 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸1 min， 30个循环，再72℃延伸10 min，PCR扩增的序列由上海生工生物工程公司进行测序。

4) 系统树的创建

将测得的16S rDNA序列发送到DDBJ (DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)数据库中的Blast中进行比对，利用CustalX2.1和Mega5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件创建系统树，采用的方法为邻接法(Neighbor-Joining)[14-17]。

2 结果

2.1 菌株的分离和筛选

首先利用格里斯试剂对富集培养液进行初步检测，筛选具有降解氨氮能力的菌株。然后对菌株进行多次驯化培养，最后用线培养法进行分离，共分离培养得到12株氨氮降解菌，从中选取氨氮降解能力最强的菌株AN-1为代表菌株，用于后面的实验。

2.2 生理生化

菌株AN-1在固体平板培养基上生长时，其菌落为乳白色圆形，表面湿润光滑，显微镜观察该菌为杆状(图1)。根据《常见细菌系统鉴定手册》对氨氮降解菌AN-1的形态特征、生理生化特征等进行了鉴定,结果如表1所示。

2.3 菌株AN-1生长曲线测定

将菌株AN-1在液体培养基中进行振荡培养，每隔1 d测定培养液的吸光度(OD560)，作成如图2所示的生长曲线。从图2可以看出，菌株AN-1的停滞期较短，经过24 h左右的培养后便进入了对数增长期。在培养到72 h时生物量达到最大，在此后的培养过程中，生物量基本保持不变。

图1 氨氮降解菌株AN-1分离、纯化菌落

鉴定指标菌株AN-1革兰氏染色(Gram-stain)—接触酶(Catalase)+氧化酶(Oxidase)+乙酰甲基甲醇(V.P.)实验(Voges-Proskauerreaction)—硝酸盐还原(Nitratesreducedtonitrites)—亚硝酸盐还原(Nitritesreducedtonitrites)+葡萄糖(Glucose)+淀粉水解(Amylase)—

注：“+”：阳性或有反应；“-”：阴性或没反应

2.4 不同pH条件下的氨氮去除率

将菌株AN-1分别接种到pH为6.0、7.0、8.0和9.0的培养基中进行振荡培养，培养温度为30℃，培养到5 d时，测定培养液中剩余氨氮含量，分别求出氨氮降解率，作出pH～氨氮降解率曲线，如图3所示。可以看出，菌株AN-1 在pH 8.0左右表现出最高的氨氮降解率，为78%。pH为9.0的培养基中生长时，菌株AN-1的降解率仅有47%，pH为6.0时的氨氮降解率为50%。由此可见，菌株AN-1的氨氮降解最适pH值在8.0左右，pH过高和过低都不利于氨氮降解。

图2 菌株AN-1生长曲线

图3 菌株AN-1在不同pH条件下的氨氮去除率

2.5 不同温度条件下的氨氮去除率

分别在10、20、30和40 ℃条件对菌株AN-1进行振荡(160 r/min)培养5 d，培养基pH均为8.0，每隔1 d测定培养液中氨氮含量，求出氨氮去除率并作不同温度条件下的培养时间～氨氮去除率曲线，如图4所示。从图4可以看出，菌株AN-1在30℃培养时，氨氮去除率最高，达77%。10℃条件下培养，其氨氮去除率仅为20%，40℃培养条件下的氨氮去除率为25%，稍高于10℃培养条件下的氨氮去除率。可以看出，菌株AN-1适宜生长的温度为30℃左右，温度过高或过低，都会降低其氨氮去除率。

图4 培养温度对菌株AN-1氨氮去除率影响

2.6 氨氮降解菌系统分类位置

经过序列测定，菌株AN-1 的16S rRNA的基因片段为1398 bp。通过数据库DDBJ(DNA Data Bank of Japan, http://www.ddbj.nig.ac.jp/)，获得菌株AN-1的登录号为AB917468。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据中，选取与菌株AN-1 16S rRNA序列同源性较高的基因序列，利用软件CustalX2.1和Mega5.0 创建系统树(图5)。利用NCBI数据库对菌株AN-1的16 S rRNA序列进行同源性分析，结果表明菌株AN-1与Shinellakummerowiae(EF070131)相似度最高，为96%。结合菌株AN-1在系统树中的位置，可以判断菌株AN-1属于申氏杆菌属,并初步命名为Shinellasp. AN-1(AB917468)。

图5 菌株AN-1(AB917468)与申氏杆菌属(Shinella)中近缘菌株16S rDNA序列的无根系统发育树(采用方法为紧邻法)

3 讨论

本研究筛选得到的申氏杆菌Shinellasp. AN-1(AB917468)具有较强的去除水体中氨氮的能力，氨氮去除率为78%，为高氨氮废水如养殖废水中去除氨氮提供了新的菌种资源。但要应用到实际的氨氮废水处理中，还需要对具体的环境因素进行分析。另外，如果对菌株AN-1进行新菌种鉴定还需要进行DNA-DNA杂交，DNA G+C含量测定、脂肪酸组成分析等工作。

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(责任编辑：吕海亮)

Isolation of an Ammonia-nitrogen Degrading Bacterium and Its Removal Capability

LIU Yaqiao, HAN Xuejun, TAN Haochen, LU Hongsheng

(College of Chemical and Environmental Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao, Shandong 266590, China)

The objective of this study is to isolate and identify the bacteria with high ammonia-nitrogen degrading capability degrading and to apply the bacteria to wastewater denitrification treatment. 12 strains of ammonia-nitrogen degrading bacteria were isolated from activated sludge and the bacterium with the highest ammonia-nitrogen degrading capability (strain AN-1) was selected and its morphology, biochemical properties, phylogenetic position and ammonia-nitrogen degrading capability under different conditions were examined. The results indicate that strain AN-1 is a Gram-negative, rhabditiform bacterium, whose colony is milk white, and both its catalase and oxidase are positive. Strain AN-1 has the optimum ammonia-nitrogen degradation effect when the temperature is 30 ℃ and the pH value is 8.0. Its maximum removal rate can reach 78%. The 16S rDNA sequence of strain AN-1shows the highest similarity of 95% with its closely related bacteria ofShinellazoogloeoides(GU930756). It is thus concluded that strain AN-1, with high ammonia-nitrogen degrading capability, is one member of genusShinella.

ammonia-nitrogen degrading bacterium; genusShinella; activated sludge; isolation

2016-11-02

山东省博士后基金项目(20101008);山东省博士后创新基金项目(201201008)

刘亚樵(1991—)，女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事污水处理研究. 陆洪省(1972—)，男，山东沂水人，副教授，博士，主要从事污水处理以及土壤环境修复研究，本文通信作者.E-mail：hslu628@163.com

X172

A

1672-3767(2017)02-0070-06