田玉路，王宏侠，高 萌，赵丽丽，张兰桐，王 巧

(河北医科大学药学院药物分析教研室，河北 石家庄 050017)

·论 著·

高效液相色谱法测定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量

田玉路，王宏侠，高 萌，赵丽丽，张兰桐，王 巧*

(河北医科大学药学院药物分析教研室，河北 石家庄 050017)

目的对前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素常用的高效液相色谱法含量测定方法进行改进，用于市售前胡的分析。方法改用甲醇作为提取溶剂，超声处理时间为30 min，提取液直接测定分析。采用Thermo ODS HYPERSIL色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，以甲醇-水(68∶32)为流动相。结果白花前胡甲素和白花前胡乙素分别在5.00～400.00 mg/L和0.50～40.00 mg/L范围内线性关系良好，回归方程分别为Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99)和Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99)，精密度为0.6%～2.0%，加样回收率为90.7%～104.8%。采用建立的方法对9批市售前胡进行了测定。结论该方法更简便、快速、重复性好，可准确测定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素。

前胡；白花前胡甲素；白花前胡乙素；高效液相色谱法

前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根，具有降气化痰、散风清热的功效，主要用于治疗痰热喘满、咯痰黄稠、风热咳嗽痰多等症[1]，其主要化学成分为香豆素类化合物[2-4]，文献报道香豆素类化合物具有多方面的药理作用[5-16]。目前常通过高效液相色谱法检测[1，17-19]，采用白花前胡甲素和白花前胡乙素作为定量指标控制前胡的质量。这些方法制备供试品溶液时常采用三氯甲烷作为提取溶剂，溶剂毒性较大，并且有溶剂挥干过程，操作较繁琐，条件不易控制。为此，本研究对白花前胡甲素和白花前胡乙素的高效液相色谱法含量方法进行改进，以期为前胡质量控制提供一简单、重现性好、环境又好的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 1200系列高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，包括四元泵(G1311A)，自动进样器(G1329A)，VWD检测器(G1314B)，DAD检测器(G1315D)，在线脱气机(G1322A)以及柱温箱(G1316A)；KQ5200E型超声波清洗器(功率200 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)；FW80型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；PW系列超纯水系统(力康生物医疗科技控股有限公司)。

1.2 试药 白花前胡甲素(批号：111711-200602)和白花前胡乙素(批号：111904-201203)对照品均购自于中国食品药品检定研究院。水为超纯水，甲醇为色谱纯(美国天地有限公司)和分析纯(天津市永大化学试剂有限公司)。9批前胡分别收集于不同地区，并经河北省食品药品检验研究院段吉平主任药师进行生药学鉴定。各样品均由FW80型高速万能粉碎机粉碎，粉末过3号筛保存于干燥器内备用。

1.3 色谱条件 Thermo ODS HYPERSIL色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(68∶32)；流速0.8 mL/min；检测波长322 nm；柱温30 ℃，进样体积10 μL。对照品溶液和供试品溶液的高效液相色谱法色谱图见图1。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品溶液的制备 取白花前胡甲素和白花前胡乙素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含白花前胡甲素400 mg/L和白花前胡乙素40 mg/L的混合对照品溶液，过微孔滤膜(0.45 μm)，即得。

1.4.2 供试品溶液的制备 取前胡粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜(0.45 μm)，即得供试品溶液。

图1 对照品和样品高效液相色谱法色谱图

A.对照品；B.样品；1.白花前胡甲素；2.白花前胡乙素

Figure 1 The high performance liquid chromatography chromatograms of standard and sample solution

1.5 方法学验证

1.5.1 重复性试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样5次，计算白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值，考察仪器重复性。

1.5.2 标准曲线及线性范围 将混合对照品溶液依次用甲醇稀释，得到分别含白花前胡甲素400、200、100、50、10、5 mg/L；白花前胡乙素40、20、10、5、1、0.5 mg/L的系列混合对照品溶液，过微孔滤膜(0.45 μm)，即得标准曲线溶液。分别精密吸取各标准曲线溶液10 μL进样分析，以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标用加权最小二乘法(W=1/X)进行一元线性回归，绘制标准曲线。标准曲线的准确度按如下公式计算：相对误差(relative error，RE)(%)=(回归浓度-实际浓度)/实际浓度×100%。

1.5.3 检测限与定量限 将混合对照品溶液逐步稀释并进行测定，以信噪比(signal-noise ratio，S/N)=3和S/N=10时分析物的浓度为检测限和定量限。

1.5.4 精密度试验 按供试品溶液的制备方法，平行制备6份，连续重复3 d，测定含量，计算日内精密度RSD值和日间精密度RSD值，考察方法的精密度。

1.5.5 回收率试验 取前胡粉末，精密称定9份(各0.050 g)，分别精密加入同一浓度混合对照品溶液2.5、5.0、7.5 mL，各平行3份，精密加入甲醇补足至10 mL，按供试品溶液的制备方法，制备溶液，测定分析物的含量并计算回收率。加样回收率按如下公式计算：(测得量-药材中量)/加入量×100%。

1.5.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于室温放置0、12、24 h时进样分析，测定分析物的浓度，考察方法的稳定性。

1.5.7 样品测定 分别取各前胡样品制备供试品溶液，并注入液相色谱仪测定白花前胡甲素和白花前胡乙素的峰面积，按标准曲线法计算含量。

2 结 果

2.1 方法学验证 重复性测定结果白花前胡甲素和白花前胡乙素峰面积的RSD分别为0.4%和0.5%，表明该仪器重复性良好。回归方程为：白花前胡甲素Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99)线性范围5.00～400.00 mg/L；白花前胡乙素Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99)，线性范围0.50～40.00 mg/L。白花前胡甲素和白花前胡乙素各浓度点的RE值为-0.8%～1.0%。白花前胡甲素和白花前胡乙素的检测限分别为0.039 7 mg/L和0.103 7 mg/L，定量限分别为0.198 5 mg/L和0.518 4 mg/L。白花前胡甲素的日内与日间精密度分别为0.9%和2.0%；白花前胡乙素的日内与日间精密度分别为0.6%和1.4%。加样回收率为90.7%～104.8%，回收率试验结果见表1，2。稳定性结果白花前胡甲素和白花前胡乙素在3个时间点浓度差异的RSD均<2.0%，表明该法稳定性良好。

2.2 样品测定 白花前胡甲素的含量为0.73%～2.24%，白花前胡乙素的含量为0.12%～0.33%，见表3。

表1 白花前胡甲素回收率试验结果

表2 白花前胡乙素回收率试验结果

表3 前胡样品中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量测定结果

3 讨 论

3.1 提取方法 《中国药典》(2015年版)与文献报道[17-18]常采用三氯甲烷作为提取溶剂进行实验，为了避免提取溶剂三氯甲烷对色谱系统的影响，在制备供试品溶液时需要先将三氯甲烷除去，因此常涉及溶液的挥干、转移操作，致使方法繁琐。另外，因方法中有滤过操作，由于三氯甲烷的强挥发性，往往使过滤前后溶液浓度易发生改变，条件不易控制，且三氯甲烷具有较明显的毒性。

针对以上问题，本研究尝试通过改变提取溶剂进行方法改进。依照方法，比较了常用提取溶剂氯仿、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮对2种成分的提取效果，结果发现，氯仿和乙醚分别对白花前胡甲素和白花前胡乙素具有最高的提取效率，甲醇对白花前胡甲素的提取仅次于氯仿，无水乙醇、乙酸乙酯、乙醚和丙酮对白花前胡甲素均不能有效提取，甲醇和乙醚对白花前胡乙素的提取效率相近。因此本研究选择甲醇替代氯仿作为提取溶剂，既避免了溶剂的强挥发性对测定结果的影响，也因为甲醇与反相色谱适用而省去挥干溶剂的过程。

为了达到最佳提取效率，考察了不同超声时间(10、20、30、40、50 min)，结果显示，超声30 min时白花前胡甲素和白花前胡乙素的提取效率最高。为了考察是否提取完全，将提取后残渣用甲醇洗净，再进行第2次提取，经检测发现，第2次提取液中白花前胡甲素峰面积占第1次提取液中峰面积的0.045 4%，且未检测到白花前胡乙素峰，故可认为甲醇超声提取30 min可达到完全提取。

3.2 色谱条件 本研究初期尝试了DIKMA Diamonsil C18(2)(4.6×250 mm，5 μm)、Purospher STARLP RP-18 endcapped(4.6×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm，5 μm)和Thermo ODS HYPERSIL(4.6×250 mm，5 μm) 4种色谱柱进行测定，结果发现，相对于白花前胡甲素，白花前胡乙素易受到其他色谱峰的干扰，仅在一种色谱柱上达到良好分离效果，在其他色谱柱上不仅无法分离，且易与相邻峰合并为一个色谱峰，即使改变流动相比例也无法改善。如此，其他色谱峰产生的峰面积也易按白花前胡乙素计，致使白花前胡乙素测定结果偏高，产生较大误差。根据以上结果可以看出，白花前胡甲素和白花前胡乙素2种成分的测定对色谱柱的要求较严格，尤其是后者，因此，对2种成分测定时应选择合适的色谱柱，并注意峰分离情况。

3.3 改进方法与药典方法比较 本研究以《中国药典》(2015年版)中记载的方法为例，与改进方法的含量测定结果进行比较。可以看出有7批样品的含量测定结果改进方法略高于药典方法，说明本研究方法显示出较高的提取效率。改进方法操作简单、结果准确，且首次注意到白花前胡乙素在色谱分离时出现的峰包合现象，可用于前胡的质量控制。

3.4 市售前胡样品质量分析 《中国药典》(2015年版)规定前胡样品按干燥品计算，含白花前胡甲素不得少于0.90%，含白花前胡乙素不得少于0.24%。改进方法样品测定结果可知，采集的9批样品中仅有一批样品(样品1)2种成分含量都合格，白花前胡甲素合格或白花前胡乙素合格的各有4批样品。若按《中国药典》(2015年版)中规定的含量测定方法测定，同样是不合格的结果。以上结果初步说明，市售前胡样品合格率极低，且各批次间的含量测定结果偏差较大，提示前胡质量和市场亟待有效控制和管理。

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(本文编辑：赵丽洁)

Determination of contents of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix by high performance liquid chromatography

TIAN Yu-lu, WANG Hong-xia, GAO Meng, ZHAO Li-li, ZHANG Lan-tong, WANG Qiao*

(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,theSchoolofPharmacy，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To improve the method for the determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix by high performance liquid chromatography. Then the method was used for the analysis of commercial “Qian Hu”. Methods Methanol was used as the extraction solvent and ultrasonic extraction time was 30 min. The extract was analyzed directly. The separation was performed on a Thermo ODS HYPERSIL(4.6×250 mm, 5 μm) column using methanol and water(68∶32) as mobile phase. Results The methodology validation presented that praeruptorin A and praeruptorin B were in good correlation in the range of 5.00-400.00 mg/L and 0.50-40.00 mg/L with the regression equations of Y=28.478 222 4X+6.484 094(r=0.999 99) and Y=25.589 318 7X-0.328 822(r=0.999 99), respectively. The results of the precision (RSD) and recoveries were in the range of 0.6%-2.0% and 90.7%-104.8%, respectively. Nine batches of commercial “Qian Hu” were determined by the established method. Conclusion The method is simpler, more rapid and more reproducible. It can be used for the accurate determination of praeruptorin A and praeruptorin B in Peucedani Radix.

Peucedani Radix; praeruptorin A; praeruptorin B; high performance liquid chromatography

2016-03-11；

2016-04-08

田玉路(1989-)，女，河北曲阳人，河北医科大学药学院理学硕士研究生，从事药物质量控制研究。

*通讯作者。E-mail：qiaowang88@hotmail.com

R917

A

1007-3205(2017)03-0331-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.020