韩淑娴+陈影+张倩+韩冰+葛一蒙+项彦华+廖福龙+游云

[摘要]研究流動条件下血栓通胶囊（XST）抗血小板黏附的效应及其可能的作用机制。利用BioFlux 1000控剪应力微流培养系统模拟体内流动条件，建立TNFα诱导的血管内皮细胞损伤模型，动态实时观察XST（03 g·L1）对血小板黏附于受损血管内皮细胞表面的影响。以Western blotting法测定血管内皮细胞VCAM1的表达，以放射免疫法检测6ketoPGF1α，TXB2的分泌。结果显示，生理和病理流动条件下XST均可抑制血小板黏附，抑制率分别为150%，341%；在病理低剪应力或静态条件下，XST能够明显抑制血管内皮细胞VCAM1的表达和TXB2释放（P<005）。该研究从血流/血管/血液相互作用的角度发现，XST可能通过内皮细胞保护途径，抑制血小板黏附，进而发挥其抗血栓形成的效应。在不同流动条件下，XST抗血小板黏附的效应有所不同，病理低剪应力更有利于XST药效的发挥。

[关键词]剪应力； 血栓通胶囊； 血管内皮细胞； 血小板

Antiplatelet adhesive effect and mechanisms of Xueshuantong

capsules under flow conditions

HAN Shuxian1， CHEN Ying1， ZHANG Qian1， HAN Bing2， GE Yimeng2， XIANG Yanhua2， LIAO Fulong1， YOU Yun1*

（1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Science， Beijing 100700， China；

2. Harbin Zhenbao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Harbin 150060， China）

[Abstract]To investigate the antiplatelet adhesive effect and possible mechanisms of Xueshuantong capsule （XST） under flow conditions Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） and human platelets were employed as experimental materials， and TNFα （20 μg·L-1） was used to establish vascular endothelial cell injury models In vivo flow conditions were simulated under controlled shear stress of 01 Pa and 09 Pa by Bioflux1000 assays accordingly Antiplatelet adhesive effects of XST at 03 g·L1 were dynamically monitored by microscopic timelapse photography Western blotting was employed to detect the VCAM1 expression on endothelial cells， and the release of 6ketoPGF1α and TXB2 was tested by radioimmunoassay The results showed that XST could inhibit the platelets adhesion under both physiological and pathological flow conditions， and the inhibition rate was 150% and 341% respectively Under pathological low shear stress or static conditions， XST could significantly inhibit endothelial cells VCAM1 expression and TXB2 release （P<005） These results suggested that XST inhibited platelets adhering to injured endothelium via decreasing VCAM1 expression and TXA2 secretion from endothelium From the interactions among blood flow， vascular endothelium and platelets， the antithrombosis effects of XST were possibly related to endothelial cells protection and therefore inhibiting platelets adhesion Under different flow conditions， the antiplatelet adhesion effect of XST was different， and the pathological low shear stress was more conducive to the efficacy of XST.

[Key words]Shear stress； Xueshuantong capsule； vascular endothelial cells； platelets

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）导致的心、脑血管疾病已经成为危害人类健康的主要疾病[1]。AS的主要并发症是血栓形成（atherothrombosis）。血小板在血栓形成中发挥关键作用。血液在血管内的流动，对血管内皮细胞产生了平行于血流方向的剪应力，以及垂直于血流方向的应力（包括压力与牵张力）。异常的血流剪切应力会导致多种血栓性疾病[23]，例如：在高剪切流场诱导下血小板表面的膜糖蛋白（GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅡb/Ⅲa）与血浆中的von Willebrand因子（vWF）相结合，介导血小板的活化、黏附和聚集，是动脉血栓的重要成因；异常的血流剪应力会导致PCI术后内膜增生，支架后再狭窄，动静脉旁路血栓形成；而在静脉系统，异常的血流剪应力可引起静脉炎和红色血栓形成。因此模拟血流力学环境，通过抑制血小板与血管内皮下基质的黏附，阻断血栓形成，已成为新的抗血栓治疗策略。

三七Panax notoginseng （Burk） FHChen具有化瘀止血，活血定痛之效，可用于治疗各种出血病症及跌打损伤所致的瘀血肿痛[4]。三七总皂苷（total saponins of P. notognseng，PNS）被认为是三七最主要的活性成分，其中含有多种单体皂苷，包括人参皂苷Rg1，Rb1，Re，Rd，Rb2，Rb3，Rc，以及少量的三七皂苷R1，R2，R3，R6[56]。PNS具有抑制血小板聚集、抗心肌缺血、抗腦缺血、抗炎、抗氧化、保护内皮细胞等药理作用[711]。此外，三七皂苷R1等可明显抑制oxLDL诱导的血小板内皮细胞黏附[12]。血栓通胶囊（XST）的主要成分是三七总皂苷，临床用于防治脑络瘀阻引起的中风偏瘫，心脉瘀阻引起的胸痹心痛。但是目前尚无对血栓通胶囊防治血栓形成的分子药理机制研究。本研究假设在不同流动条件下，XST可能对血小板黏附功能、内皮细胞黏附蛋白VCAM1的表达及PGI2，TXA2的分泌产生不同影响。采用Bioflux1000微流培养系统[13]，模拟生理或者病理流动条件，建立肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导的血管内皮细胞炎症模型，观察XST防治血栓形成的作用机制。

1材料

11细胞

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）（美国Sciencell公司，5138）；健康成年人血小板（北京医院检验科提供）。

12药物与试剂

血栓通胶囊（规格，三七总皂苷100 mg/180 mg胶囊，珍宝岛药业，20140310）。阿司匹林（美国Sigma公司）；ECM培养基（美国ScienCell公司，12376）；TNFα（美国PEPROTECH公司，0906CY25）；甘氨酸，SDS，Tris，AP，Acry，BisAcrylamide，TEMED，脱脂奶粉（美国Amresco公司）；RIPA裂解缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司，c1053）；兔抗人VCAM1单克隆抗体（Santa公司，sc8304）；小鼠抗人βactin单克隆抗体（Santa公司，sc47778）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（北京普利莱基因技术有限公司，c1308）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（北京普利莱基因技术有限公司，c1309）；6ketoPGF1α放射免疫分析试剂盒、TXB2放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所有限公司）。

13仪器

Bioflux1000控剪应力微流细胞培养系统及全自动分析工作站、Bioflux 48孔微流培养板（美国Fluxion Biosciences公司）；Axiovret 135A倒置显微镜（德国ZEISS公司）；MCO15A型CO2培养箱（日本三洋电机国际贸易有限公司）；超净工作台（北京半导体设备一厂）；细胞培养瓶及细胞刮刀（美国Corning公司）；DT56A型台式离心机（北京时代北利离心机有限公司）；5424R型冷冻高速台式离心机、微量移液器（德国Eppendorf公司）；Spectra Max M5多功能酶标仪（美国分子仪器公司）；MiniPROTEAN电泳系统（美国BIORAD公司）；DYY6D型电泳仪（北京六一仪器厂）；Gene Genius凝胶成像系统（英国Syngene公司）；KQ2200B超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；ZD9550型脱色摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造公司）；DFM96 r放射免疫计数仪（合肥众成机电）。

2方法

21剂量设置及分组

血栓通溶液的配制：精密称取XST内容物粉末约6001 mg，加入生理盐水5 mL量瓶定容，常温超声30 min，3 500 r·min-1离心5 min，吸取上清液，02 μm微孔滤膜过滤后，HPLC法进行含量测定[14]，三七总皂苷质量浓度为6667 g·L-1，4 ℃储存备用。实验前37 ℃温育20 min，以ECM培养基配成所需工作浓度。

阿司匹林溶液的配制：精密称取阿司匹林粉末约2252 mg，以PBS溶液溶于25 mL量瓶中，调节pH至72～74，定容，配成浓度为50 mmol·L-1的实验用母液，02 μm微孔滤膜过滤，4 ℃储存备用。以ECM培养基配成所需工作浓度。

流动状态细胞分组：实验设置01，09 Pa 2种剪应力水平，每种剪应力水平设置正常对照组、模型组、实验组、阳性对照组。实验组给药剂量根据预实验结果设定为03 g·L-1。阿司匹林终浓度为1 mmol·L-1。共设8个组，每组各设3个复孔。

静态细胞分组：实验设置正常对照组、模型组、实验组、阳性对照组。实验组XST终浓度分别为06，03 g·L-1，阿司匹林溶液终浓度为1 mmol·L-1。

韩淑娴等：流动条件下血栓通胶囊抗血小板黏附的分子药理学机制研究22细胞培养

血管内皮细胞接种到25 cm2培养瓶中，加入适量ECM培养基，于37 ℃，5%CO2培养箱内静置培养。3～8代用于实验。

23药物与流动预处理及TNFα损伤模型的建立

采用BioFlux 1000控剪应力微流培养系统在流动条件下培养内皮细胞[15]。铺被Ⅰ型鼠尾胶原（006 g·L-1）于48孔微流培养板，20 μL内皮细胞悬液（2×1010～3×1010 个/L）加至微流通道[16]，利用液体压力差维持培养基流动内皮细胞的生长，37 ℃孵箱过夜。微流观察通道的细胞达到90%融合后，分别施加01，09 Pa剪应力，使不同水平剪应力与药物预处理细胞12 h。加入含TNFα（20 μg·L-1）的培养基与内皮细胞共培养2 h，正常对照组加入等体积的ECM培养基。收集细胞上清液，-20 ℃冻存，备测。

24血小板黏附

将300 μL（约25×1011 个/L）人血小板悬液加入微流观察通道，37 ℃，001 Pa记录血小板的黏附过程，记录时间为45 min；采图，每组至少3张，计数黏附的血小板。吸弃剩余血小板悬液，PBS溶液冲洗通道后，用含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA细胞裂解液裂解通道内细胞，收集流出液，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液，-20 ℃冻存，用于Western blotting蛋白电泳分析。

25静态细胞处理

取对数生长期的血管内皮细胞，025%胰蛋白酶常规消化制成单细胞悬液，接种于6 cm培养皿中，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。当培养皿中细胞达到90%融合后，按照21所述静态细胞分组加药，于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育12 h。吸弃含药培养基，将含20 μg·L-1TNFα的培养基加入模型组、实验组、阳性对照组，37 ℃孵育2 h。吸弃培养基，预冷的PBS溶液洗涤2遍，加入含1 mmol·L-1 PMSF的RIPA细胞裂解液，冰上裂解细胞15 min，收集细胞裂解液，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液，-20 ℃冻存，用于Western blotting蛋白电泳分析。

26Western blotting法检测黏附蛋白VCAM1表达

采用BCA法测定蛋白浓度，经SDSPAGE电泳后，湿转法转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温下封闭2 h；分别加入VCAM1抗体，4 ℃孵育过夜，TBST （100 mmol·L-1Tris，100 mmol·L1 NaCl，01%Tween）漂洗3次，每次5 min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h。TBST洗膜3次，每次5 min。滴加ECL发光液，用凝胶成像系统进行扫描成像。Image J軟件进行灰度分析。

27放射免疫法检测细胞上清液中6ketoPGF1α，TXB2含量

血管内皮细胞接种于96孔板中，每孔1×104个，实验设置正常对照组、模型组、实验组、阿司匹林组，每组各设6个复孔。细胞与药物于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育12 h，将含20 μg·L-1TNFα的培养基加入模型组、实验组、阳性对照组，37 ℃孵育2 h。收集细胞上清液，-20 ℃冻存，备测。以放射免疫法检测TXB2（TXA2的代谢产物）和6ketoPGF1α（PGI2的代谢产物）含量。

28统计处理

统计变量以±s表示，利用SPSS 200 统计软件对实验数据进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<005为有统计学意义。

3结果

31不同流动条件下XST对血小板黏附的影响

在01，09 Pa流动条件下，各个处理组黏附于TNFα损伤的内皮细胞表面的血小板数量见表1。在不同流动条件下，XST均可明显抑制TNFα诱导的血小板内皮细胞黏附，抑制率分别为341%，150%。

32XST对血管内皮细胞黏附蛋白VCAM1表达的影响

321静态条件下XST对VCAM1表达的影响

静态条件下XST可抑制TNFα诱导的VCAM1的表达。与对照组相比，模型组VCAM1蛋白表达量明显升高；与模型组相比，XST（03，06 g·L-1）及阿司匹林（1 mmol·L-1）可明显抑制VCAM1的表达，抑制率分别为165%，219%，226%（图1）。

322流动条件下XST对VCAM1蛋白表达的影响01 Pa流动条件下，XST可明显抑制VCAM1的表达。与对照组相比，模型组VCAM1蛋白表达量明显升高；与模型组相比，XST可明显抑制VCAM1的表达，抑制率为246%，蛋白表达量低于阿司匹林（图2）；09 Pa流动条件下，XST对VCAM1表达的影响不明显，但阿司匹林可明显抑制VCAM1的表达，抑制率为167%（图3）。

33流动条件下，XST对血管内皮细胞分泌6ketoPGF1α，TXB2的影响

流动条件下，XST可明显抑制TNFα诱导的血管内皮细胞分泌TXB2。与对照组相比，模型组血管内皮细胞分泌的TXB2含量明显升高，与模型组相比，XST、阿司匹林均可明显抑制TXB2的分泌，抑制率分别为499%，654%（图4），XST、阿司匹林对血管内皮细胞分泌6ketoPGF1α无明显影响，统计学分析没有显著性差异。

4讨论

本实验室在前期研究工作中发现XST具有抑制血小板聚集的效应，虽然效力低于阿司匹林，但是XST抑制血小板聚集效应稳定并具有一定的量效关系[14]。本研究是在前期研究工作基础上，探索XST抑制血小板聚集的可能机制及分子机制。

血栓形成过程是血管内皮细胞、血小板、凝血因子及力学环境交互作用的复杂过程。首先血管内皮功能紊乱或者结构受损，使正常血管内壁的抗凝特性减弱或丧失；血小板在内皮损伤部位首先发生黏附、变形和聚集，并招募凝血蛋白及多种血细胞促进血栓形成。在这个过程中，血流力学环境是影响血栓形成的一个重要因素，特别是剪应力能够直接影响血管内皮细胞的结构和功能。正常动脉中流体剪应力大约为1～7 Pa，动脉粥样硬化易发的区域，流体剪应力显著降低（<04 Pa），血流状态往往为紊流[17]。低剪切应力（<04 Pa）可诱导内皮细胞增殖、炎症基因的表达增加，NO 生成减少，白细胞黏附及渗透增加[18]。静脉血管压力升高会增强MMP1，8，9及TIMP1，2等酶的活性，这将影响临界表面受体的活性，而导致炎症的发生及内皮功能紊乱[15]。本实验中01 Pa属于偏低的病理血流剪应力，09 Pa则属于正常水平的生理血流剪应力。在不同流动条件下，XST抑制血小板黏附的效应有所差异，提示剪应力影响XST抗血小板黏附的效应。在低剪应力流动条件下，XST抑制血小板黏附的效应与阿司匹林相近，抑制率分别为341%，363%。

在炎症反应部位，内皮细胞受到致炎因子的刺激后，其表面黏附蛋白表达量增高[19]。VCAM1 是一种重要的黏附分子，是免疫球蛋白超家族成员，在血管损伤炎症过程中起重要作用[20]。低剪应力（02 Pa）作用于内皮细胞可导致黏附分子VCAM1表达上调，在血小板黏附过程中起重要作用[21]。本研究结果表明在不同血流状态下，药物抑制黏附蛋白表达的效应有所差异，在病理流动条件下，XST抑制血管内皮细胞黏附蛋白VCAM1表达的作用更明显，与阿司匹林相比，XST抑制VCAM1表达的效应更强（P<001）。以上结果提示，在病理低剪应力条件下XST抑制VCAM1表达的效应可能优于阿司匹林。

血小板活化释放的TXA2通过刺激血管内皮细胞TXA2受体，升高胞内Ca2+浓度，加速血小板激活与聚集、血细胞黏附、血管收缩等生物学效应。研究发现，oxLDL诱导血管内皮细胞分泌TXB2增加，三七皂苷R1可明显抑制其分泌[12]。复方血栓通胶囊（由三七、黄芪、丹参、玄参组成）075 g·kg-1能明显升高大鼠血清PGI2含量，降低TXA2含量及TXA2/PGI2比值，从而发挥抗血栓形成的作用[22]。本研究发现，TNFα刺激后，血管内皮细胞分泌TXB2增加；XST、阿司匹林均明显抑制血管内皮细胞分泌TXB2，阿司匹林的抑制效应强于XST（P<001）。此外，本实验研究结果显示与静态条件相比，流动条件下XST具有明显升高6ketoPGF1α/ TXB2比值的效应（047±008 vs 070±001）。

综上所述，本研究从血流/血管/血液相互作用的角度研究发现，XST可能通过抑制血管内皮细胞VCAM1的表达及TXA2的分泌，抑制血小板黏附于损伤的内皮细胞表面，从而发挥防治血栓形成。研究发现在病理低剪应力条件下XST可能更好地发挥其抗血小板黏附以及内皮保护效应。生物力学环境直接影响药物效应的发挥，通过建立相应的动态力学药物筛选模型，有助于发现抗血小板聚集的中药及其组合物。

[参考文献]

[1]杨永宗动脉粥硬化性心血管病基础与临床[M]2版北京：科学出版社，2009：28

[2]游云，张毅，廖福龙血流剪应力、生物力药理学与疾病防治[J]微循环学杂志，2010，20（3）：53

[3]Chiu J J， Chien S Effects of disturbed flow on vascular endothelium： pathophysiological basis and clinical perspectives[J] Physiol Rev， 2011， 91（1）： 327

[4]段寅慧，吳敏三七总皂苷药理研究及临床应用进展[J]中医药信息，2014，31（2）：108

[5]Wan J B， Zhang Q W， Hong S J， et al Chemical investigation of saponins in different parts of Panax notoginseng by pressurized liquid extraction and liquid chromatographyelectrospray ionizationtandem mass spectrometry[J] Molecules， 2012， 17（5）： 5836

[6]Shi S M， Liu Y Z， Tai W， et al Smashing tissue extraction and HPLC determination of active saponins from different parts of Panax notoginseng [J] Chin Herb Med， 2012， 4（4）： 340

[7]罗世江三七止血与抗血栓作用的实验观察[J] 贵阳中医学院学报，2013，35（1）：260

[8]Chen S X， Liu J L， Liu X Y， et al Panax notoginseng saponins inhibit ischemiainduced apoptosis by activating PI3K/Akt pathway in cardiomyocytes[J] J Ethnopharmacol， 2011， 137： 263

[9]Han S Y， Li H X， Ma X， et al Evaluation of the antimyocardial ischemia effect of individual and combined extracts of Panax notoginseng and Carthamus tinctorius in rats[J] J Ethnopharmacol， 2013， 145（3）： 722

[10]刘桂林，窦迎春，刘粉叶，等三七总皂苷对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞 CD40，VCAM1表达的影响[J]山东大学学报：医学版，2010，48（10）：14

[11]Jia C L， Xiong M Q， Wang P W， et al Notoginsenoside R1 attenuates atherosclerotic lesions in ApoE deficient mouse model[J] PLoS ONE， 2014， 9（6）：e99849

[12]Wang M M， Xue M， Xu Y G，et al Panax notoginseng saponin is superior to aspirin in inhibiting platelet adhesion to injured endothelial cells through COX pathway in vitro[J] Thromb Res，2016，141：146

[13]游云，龚曼，李玉洁，等剪应力联合参莲提取物对血管内皮细胞炎症蛋白表达的影响[J]中國实验方剂学杂志，2012，18（23）：261

[14]韩冰，毛鑫，韩淑娴，等基于抑制血小板聚集活性检测的血栓通胶囊质量控制研究[J]中国中药杂志，2015，40（23）：4597

[15]Tom Alsaigh， Elizabeth S Pocock， John J Bergan， et al Acute venous occlusion enhances matrix metalloprotease activity implications on endothelial dysfunction[J] NIH Public Access， 2011， 81（1）： 108

[16]You Y， Liu W H， Li Y J， et al Joint preventive effects of swimming and Shenlian extract on rat atherosclerosis[J] Clin Hemorheol Microcirc， 2011， 47（3）： 187

[17]Li J， Hou B， Beech D J Endothelial Piezo1： life depends on it [J] Channels， 2015， 9（1）： 1

[18]Zhou J， Li Y S， Chien S Shear stressinitiated signaling and its regulation of endothelial function[J] Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2014， 34（10）： 2191

[19]Jaipersad A S， Lip G Y H， Silverman S， et al The role of monocytes in angiogenesis and atherosclerosis[J] J Am Coll Cardiol， 2014， 63： 1

[20]Park J G， Ryu S Y， Jung I H， et al Evaluation of VCAM1 antibodies as therapeutic agent for atherosclerosis in apolipoprotein Edeficient mice[J] Atherosclerosis， 2013， 226： 356

[21]Li B， Zhang J X， Wang Z M， et al Ivabradine prevents low shear stress induced endothelial inflammation and oxidative stress via mTOR/eNOS pathway[J] PLoS ONE， 2016，11（2）：e0149694

[22]聂勇胜复方血栓通胶囊抗血栓作用及其机制的实验研究[D]广州：广州中医药大学，2014

[责任编辑张宁宁]

[收稿日期]20160809

[基金项目]国家自然科学基金项目（81274006）

[通信作者] *游云，研究员，硕士生导师，研究方向为中药心脑血管药理研究与质量控制，Email： youyunrice@126com

[作者简介]韩淑娴，硕士研究生，Email： xiaoxianghsx@163com