李亚兰

摘要：指出了当前由于温室气体的增加导致全球变暖，“地球之肾”的湿地是对全球气候变化响应最敏感的区域之一，其碳氮循环也成为近年来学术界研究的热点。脱氮作用是湿地氮循环的重要功能，反硝化作用在湿地脱氮作用中占主导地位。综述了湿地生态系统反硝化作用测定及计算的一些方法，主要有乙炔抑制法、硝酸盐剩余法、气体分压法、15N同位素技术法、结合膜输入质谱检测的同位素配对法、15N成对标记法。以期为湿地氮循环研究提供参考。

关键词：湿地生态系统；氮循环；反硝化作用；测定方法

中图分类号：S156.8

文献标识码：A文章编号：1674-9944（2016）22-0032-03

1引言

湿地生态系统脱氮作用对湿地氮循环有重要意义，而氮素生物地球化学循环又进一步影响到湿地生态系统的生产力甚至是全球的气候变迁，因此脱氮过程反硝化作用是湿地土壤氮素循环不可缺少的环节之一。目前测定反硝化作用的方法有：乙炔抑制法、硝酸盐剩余法、气体分压法、15N同位素技术[1]、结合膜输入质谱检测的同位素配对法、15N成对标记等方法。笔者总结了每种测定方法的原理、操作方法、运用范围、优缺点和分析精度，以期为实验提供参考依据，也为湿地氮循环尤其是反硝化过程研究奠定基础。

2湿地生态系统的反硝化作用

河口区分布的天然湿地在减少上游径流向海洋的氮输入量及降低河口水体富营养化发生风险及危害方面作用巨大[2]。厌氧环境下，即水体中常见的含氮污染物（NO-3）可由土壤微生物介导的土壤反硝化過程转化为气态氮[3]。目前对湿地生态系统反硝化作用的研究通常意义是指硝酸盐或亚硝酸盐在缺氧条件下被还原为N2、N2O、NO等气体而进入大气之中。湿地中通过生物过程特别是脱氮作用被去除的氮可达75%，反硝化作用形成气体N2O和N2可占去除总氮量的89%～96%，是湿地生态系统氮去除的主要机制[4，5]。

3反硝化作用的测定方法

3.1乙炔抑制法

乙炔抑制法原理是一定浓度的乙炔抑制N2O还原酶的活性，反硝化过程停留在产N2O过程，将NH+4-N氧化为N2O的硝化作用也被乙炔抑制，根据N2O产生量通过计算得到反硝化速率[6]。运用氯霉素改善乙炔抑制法，给培养土添加氯霉素、硝酸钾、葡萄糖可以使反应更充分[7]。

缺点是培养过程中土壤酶被氯霉素抑制导致乙炔浓度变小，乙炔对N2O到N2这一过程所起的抑制作用降低；乙炔纯度难保证，反硝化速率测定结果不准确；土壤中硝态氮浓度较低碳含量较高时乙炔抑制剂会失去其抑制作用[8]。当土壤NO3-N含量较低时不可采取乙炔抑制法测定其反硝化速率。但乙炔抑制法在灵敏度、重现性、培养时间等方面存在独有优势。

3.2硝酸盐剩余法

硝酸盐剩余法原理是在所培养的土壤中定量添加硝态氮，样品中硝态氮含量在不同的培养阶段取样并测定，然后计算各个培养阶段硝态氮的变化量，用硝态氮变化量除以培养时间来计算反硝化速率，用硝态氮变化量除以初始量来计算其活性，培养过程需要保证厌氧淹水[9]。

优点是反硝化活性和速率可同时测定，缺点是部分NO3-N进入到土壤中后在短时间内被束缚无法参加反应[10]，测定结果可能高估土壤反硝化作用。

3.3气体分压法

气压过程分离技术（BaPS）即气体分压法是Ingwersen在1999年提出的[11]。原理是设定土壤仅有的反应过程是CO2溶于土壤水的过程、土壤硝化反硝化过程和土壤呼吸过程，则在土壤呼吸系数为1.0的条件下，可根据气压平衡原理计算反硝化速率。即测量气室气压变化和O2和CO2浓度变化推出反硝化速率。其优缺点为：①缺点是保持土壤呼吸系数为1.0，因此测定通气状况不好或太好的土壤反硝化速率将产生偏差，淹水土壤反硝化速率的测定则不适宜使用气体分压法。②优点是迅速、易做、无污染、可同时测得N2O释放速率和反硝化速率、与其它气体抑制剂添加和15Ncompoundtothesoil方法比减少了对土壤系统的干扰。

3.415N同位素技术

（1）15N平衡差值法。施入培养土壤的15N肥料总量-氨挥发的15N量-植物吸收的15N量-土壤残留的15N量=反硝化损失量。优点是氨挥发的15N和15N丰度测定真实，测定结果在没有径流和淋洗损失时可信，缺点是测出的值比实际值稍低，生物交换作用使土壤本身所含的氮与施入的15N进行交换[12]。

（2）气体通量法（15N示踪）。给土壤样品施标有15N的肥，同时测定定期从样品中采集的气体，所采样品中的CO2、O2杂质要在测定前去掉，将氮氧化物定量还原成N2，用15N示踪-质谱法测定[13]。此方法可适用于沉积物和原位土壤的植物不能被破坏的条件，并且灵敏度高。

3.515N成对标记

成对标记的原理是向培养器中添加15NO-3，在添加之前和之后分别测定15NO-3和14NO-3比率。在培养初期、中期、后期测定29N2和30N2随时间的线性变化。水溶液中加入饱和HgCl2溶液，待测N2的气体通过高温燃烧去除O2，最后通过公式计算得出反硝化的速率[14]。

15D=p29N2+p2×（30N2）

14D=（p29N2）/（2×p（30N2）×15D

Dtot=15D+14D

式中15D指加了15NO-3后，从29N2和30N2产率中得到15N2的产量；p指产量。

其优点是国内外普遍认可的新方法，此方法适用于河口沼泽湿地反硝化的测量，同时也适用于DNAR。但在沉积物反硝化速率的测定中贡献不明显。

3.6结合膜输入质谱检测的同位素配对法

将从河口湿地采集的土柱放入培养器中，从中采集出水样并将水样放入培养皿中，每间隔40min加入N2进行溶解并通过4min震荡使其达到均衡的培养，气体样品的抽取在水样之前，采用注射器在培养器中抽取气体到3.5mL的收集管中，给样品中注入15NO-3，并使其浓度在100μmol/L左右，14NO-3只保持原有的丰度[15]。然后用同位素率mass光谱仪分析14N15N/15N15N的比率，可以显示出15NO-3与14NO-3之间的平衡状况，15NO-3（D15）和14NO-3（D14）的反硝化速率可以通过公式计算得出。

这种方法适用于室内模拟培养实验，通过15NO-3的添加可更详细的测出各部分的产生物，但程序复杂，需长时间测量。

4结语

随着全球气候变暖和极端气候现象增多，人们对于气候的变化越来越关注。湿地生态系统对气候具有调节作用，其氮循环过程的重要环节反硝化作用测定和计算方法在不断修改和进步，这有利于对氮循环过程产生的温室气体N2O的进一步研究。在研究温室气体N2O的过程中发现实验条件的不同以及实验进行过程众多的影响因子要求有不同的实验方法和实验设置以保证实验成果的准确性，因此对于测定反硝化的方法要求更高。笔者综述了以上几种反硝化测定方法，可以看出，每一种方法都有它自身的优缺点和适宜范围，需要实验者更好地利用其优点，发挥其有利的价值。

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